Abstract :
[en] N-nitrosamines are a class of compounds considered potentially carcinogenic to
humans by the International Agency for Research on Cancer. Although the presence
of these compounds at trace levels has long been known, particularly in the
environment and food, the successive detection in 2018 of certain N-nitrosamines at
levels far exceeding safety thresholds in several medicinal products for human use
marked the beginning of an N-nitrosamine crisis in the global pharmaceutical industry.
To address this public health concern, international regulatory authorities rapidly
collaborated to establish guidelines aimed at framing the investigation and control of
these impurities posing a potential risk to patient safety.
This doctoral thesis is conducted within the context of this N-nitrosamine crisis in the
pharmaceutical industry and follows its evolution. In response to regulatory
requirements, this work aims to develop and validate suitable analytical methods
based on liquid chromatography hyphenated to tandem mass spectrometry (LC
MS/MS). These methods meet regulatory requirements, particularly during two key
stages of the investigation: first, the confirmation and quantification of N
nitrosamines in drugs; and second, the implementation and monitoring of risk
mitigation strategies when corrective actions are necessary to restore product
compliance, safety, and quality.
Initially, the work focused on the determination of small-molecule N-nitrosamines,
which are generic impurities that may originate from multiple sources. An innovative
approach based on quantitative structure-retention relationships (QSRR) was
proposed to support the development of LC-MS/MS methods enabling ultra-sensitive
detection of these compounds at trace levels. These methods, validated according to
ICH Q2(R2) guideline, were applied to the confirmatory testing of a marketed
medicinal product, thereby illustrating the investigation workflow recommended by
regulatory authorities.
As the N-nitrosamine crisis evolved, an unexpected turning point occurred in 2021
with the identification of a new class of N-nitrosamines: N-nitrosamine drug
substance-related impurities (NDSRIs). Unlike generic N-nitrosamines, each NDSRI
is specific to a given active pharmaceutical ingredient. Following this evolution, the
work subsequently focused on a particular NDSRI, N-nitroso-fluoxetine, formed by
nitrosation of fluoxetine in the presence of nitrosating agents. Fluoxetine is a widely
prescribed medicinal product used in the treatment of major depressive episodes. The
detection of N-nitroso-fluoxetine at levels exceeding the acceptable intake limit led to
several product recalls and ultimately to the withdrawal of a fluoxetine-based
pharmaceutical product from the Belgian market. A robust LC-MS/MS method was
developed using the Analytical Quality by Design (AQbD) approach, enabling the
simultaneous quantification of N-nitroso-fluoxetine and the detection of 13 other
small-molecule N-nitrosamines at levels below their acceptable limits. This method
was subsequently validated according to ICH Q2(R2) guideline to assess the
effectiveness of the mitigation strategies implemented to maintain the N-nitroso
fluoxetine content below its safety threshold.
Overall, this work provides analytical tools and scientific approaches contributing to
the control of N-nitrosamines in medicines, addressing regulatory requirements and
ensuring the safety and quality of pharmaceutical products.
[fr] Les nitrosamines sont une classe de composés considérés par le centre international
de recherche sur le cancer comme potentiellement carcinogènes pour l’Homme. Bien
que la présence de ces composés à l’état de traces soit connue depuis longtemps,
notamment dans l’environnement et l’alimentation, la détection successive en 2018
de certaines nitrosamines à des niveaux largement supérieurs aux seuils de sécurité
dans plusieurs médicaments à usage humain a marqué le début de la crise des
nitrosamines dans l’industrie pharmaceutique mondiale. Afin de répondre à ce
problème de santé publique, les autorités réglementaires internationales ont
rapidement collaboré pour établir des lignes directrices visant à encadrer
l’investigation et le contrôle de ces impuretés présentant un risque potentiel pour la
santé des patients.
Cette thèse de doctorat s’inscrit dans le contexte de cette crise des nitrosamines dans
l’industrie pharmaceutique et en suit l’évolution. Face aux exigences réglementaires,
ce travail vise à développer et valider des méthodes analytiques adaptées, basées sur
la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC
MS/MS). Ces méthodes satisfont aux exigences réglementaires, en particulier lors de
deux étapes clés de l’investigation : d’une part, la confirmation et la quantification des
nitrosamines dans le médicament ; d’autre part, le déploiement et le suivi des
stratégies d’atténuation du risque lorsque des mesures correctives s’imposent pour
garantir à nouveau la conformité, la sécurité et la qualité du produit.
Dans un premier temps, les travaux ont porté sur la détermination de nitrosamines de
faible masse moléculaire. Celles-ci représentent des impuretés génériques pouvant
provenir de multiples sources. Une approche innovante basée sur les relations
quantitatives structure-rétention (QSRR) a été proposée afin de soutenir le
développement de méthodes LC-MS/MS permettant leur détection à l’état de traces.
Ces méthodes, validées conformément aux recommandations ICH Q2(R2), ont été
appliquées au contrôle confirmatoire d’un médicament commercialisé, illustrant ainsi
le processus d’investigation recommandé par les autorités compétentes.
Au cours de l’évolution de la crise des nitrosamines, un tournant inattendu est survenu
en 2021 avec l’identification d’une nouvelle classe de nitrosamines : les impuretés de
nitrosamines spécifiques de substance active (NDSRIs). Contrairement aux
nitrosamines génériques, chaque NDSRI est spécifique à une substance active donnée.
Suivant cette évolution, les travaux de cette thèse se sont alors concentrés sur une
NDSRI particulière, la nitroso-fluoxétine, formée par nitrosation de la fluoxétine en
présence d’agents nitrosants. La fluoxétine est un médicament largement prescrit dans
le traitement des épisodes de dépression majeure. La détection de nitroso-fluoxétine
à des niveaux dépassant la limite d’apport autorisée a conduit à plusieurs rappels de
lots et finalement au retrait d’une spécialité pharmaceutique à base de fluoxétine du
marché belge. Une méthode LC-MS/MS robuste a été développée en appliquant
l’approche Analytical Quality by Design (AQbD), permettant la quantification
simultanée de la nitroso-fluoxétine ainsi que la détection de 13 autres nitrosamines de
faible masse moléculaire à des niveaux inférieurs à leurs limites autorisées. Cette
méthode a ensuite été validée conformément aux recommandations ICH Q2(R2) afin
d’évaluer l’efficacité des stratégies de mitigation mises en œuvre pour maintenir la
teneur en nitroso-fluoxétine en dessous de son seuil de sécurité.
L’ensemble de ces travaux propose ainsi des outils analytiques et des approches
scientifiques contribuant au contrôle des nitrosamines dans les médicaments, afin de
répondre aux exigences réglementaires et de garantir la sécurité et la qualité des
produits pharmaceutiques.
