Reference : Utilisation de biocapteurs microbiens GFP pour la caractérisation des performances de...
Dissertations and theses : Doctoral thesis
Life sciences : Biotechnology
http://hdl.handle.net/2268/164267
Utilisation de biocapteurs microbiens GFP pour la caractérisation des performances des bioréacteurs
English
[en] Use of GFP microbial biosensors for the characterization of bioreactor performances
Brognaux, Alison mailto [Université de Liège - ULiège > Gembloux Agro Bio-Tech / Département de Chimie et Bio-industries > Unité de Bio-industries > >]
1-Apr-2014
Université de Liège, ​Liège, ​​Belgique
Doctorat en Sciences Agronomiques et Ingénierie Biologique
277
Thonart, Philippe mailto
Delvigne, Frank mailto
Sindic, Marianne mailto
Vandenbol, Micheline mailto
Gorret, Nathalie
Portetelle, Daniel mailto
Twizere, Jean-Claude mailto
Crine, Michel mailto
[en] bioreactor ; biosensor ; flow cytometry ; microbial stress ; bioprocess
[fr] bioréacteur ; biocapteur ; cytométrie en flux ; stress microbien ; bioprocédé
[en] The scale-up of bioprocesses is a critical step during bioproducts development. Actually, the mixing operation’s efficiency drops when the reactor volume increases: gradients of glucose and oxygen appear when operating in fed-batch mode, causing losses of production. The aim of this project is the scale-up and sizing of bioreactors based on the direct physiological parameters to consider this heterogeneity. Concretely, it consists in obtaining an on-line signal of the physiological status of micro-organisms. The coding sequence of the Green Fluorescent Protein (GFP) has been inserted after gene promoters of interest in Escherichia coli to built biosensors. A particular focus has been paid on promoters responding to general stress or specifically to lack of glucose and on those responding to cell growth rate. The GFP biosensors of interest have been tested in scale-down bioreactors, allowing to reproduce industrial hydrodynamic conditions at a laboratory scale. A mini-bioreactor platform has also been developed to enable a high throughput screening of biosensors. The intracellular accumulation of GFP has been measured by flow cytometry and GFP release has been monitored by western blot analyses. For biosensors sensitive to stress general response or glucose limitation, GFP has been induced during a glucose limitation and repressed by comparison when glucose heterogeneities appear. The use of a destabilized GFP has been
considered in this project for ribosomal biosensors to approach more instantaneous physiological responses of microorganisms. For these ones, the response is proportional to growth rate during the batch phase, but more complex mechanisms take part during a prolonged glucose limitation. Membrane permeability has also been studied and has been noticed more important in homogeneous fed-batch bioreactors than in scale-down reactors. As GFP leakage has been noted in the extracellular medium, a study has also been carry out about proteins released in the extracellular medium (leakage), and correlated with the cell permeability. Finally, an on-line flow cytometer has been developed for the characterization of physiological status of micro-organisms during the bioprocess, and a 3D-ORM probe allowed to measure their viability on-line
[fr] L’extrapolation des bioprocédés est une étape critique lors du développement des bioproduits. Lors du passage à l’échelle industrielle, l’efficacité de l’opération de mélange diminue suite à l’augmentation du volume du réacteur : en fed-batch, des gradients de glucose et d’oxygène apparaissent, causant des pertes de production. L’objectif de ce projet est d’envisager l’extrapolation et le dimensionnement des bioréacteurs sur base de paramètres physiologiques directs afin de prendre en compte cette hétérogénéité. Concrètement, il s’agit d’obtenir un signal en ligne permettant de connaître l’état physiologique des cellules. Pour ce faire, la Green Fluorescent Protein (GFP) a été introduite à la suite de promoteurs d’intérêt chez Escherichia coli afin de réaliser des biocapteurs. Une attention particulière a été portée aux promoteurs répondant de manière générale au stress ou de manière plus spécifique au manque en glucose et à ceux répondant au taux de croissance des cellules (biocapteurs ribosomiaux). Les biocapteurs GFP d’intérêt ont été testés en réacteur scale-down, permettant de représenter à petite échelle les conditions hydrodynamiques industrielles. Une plateforme de mini-bioréacteurs a également développée afin de permettre un plus haut débit de screening de biocapteurs d’intérêt. Les observations ont été réalisées au niveau de l’accumulation interne de la GFP par cytométrie en flux et du relarguage de cette GFP dans le milieu extracellulaire par western blot. Pour les biocapteurs répondant de manière générale au stress ou plus spécifiquement au manque en glucose, la GFP a été exprimée lors d’une limitation en glucose et réprimée en comparaison lorsque les hétérogénéités de mélange apparaissent. L’emploi d’une GFP déstabilisée dans les biocapteurs ribosomiaux a permis d’obtenir une réponse physiologique plus instantanée des micro-organismes. Pour ces derniers, la réponse a été proportionnelle au taux de croissance dans la phase batch, et des mécanismes plus complexes interviennent lors d’une limitation prolongée en glucose. La perméabilité de membrane de ces biocapteurs a également été étudiée et s’est révélée être plus importante en réacteur fed-batch homogène, qu’en réacteur scale-down hétérogène. Suite à l’observation du relarguage de la GFP dans le milieu extracellulaire, une étude plus large des protéines relarguées (leakage) a aussi entreprise et a été mise en relation avec l’état de la membrane cellulaire. Finalement, la cytométrie en flux a été mise en ligne afin de pouvoir suivre l’état physiologique des micro-organismes, directement en cours de procédé, et une sonde tri-dimensionnelle a permis de mesurer leur viabilité en ligne.
Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Communauté française de Belgique) - FRIA
Researchers ; Professionals ; Students
http://hdl.handle.net/2268/164267

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