Cytométrie en flux appliquée au parenchyme rénal murin : caractérisation dynamique de la réponse immunitaire innée à 24 heures et 7 jours après ischémie-reperfusion - 2026
Cytométrie en flux appliquée au parenchyme rénal murin : caractérisation dynamique de la réponse immunitaire innée à 24 heures et 7 jours après ischémie-reperfusion
[fr] INTRODUCTION
L'ischémie-reperfusion (I/R) rénale déclenche une réponse immunitaire innée complexe dont la dynamique temporelle reste mal caractérisée. Si la cytométrie en flux (FACS) offre une résolution multiparamétrique à l'échelle unicellulaire, son application aux organes solides demeure techniquement difficile et peu standardisée dans les modèles rénaux.
DESCRIPTION
Nous avons mis au point une technique de dissociation tissulaire rénale couplée à une analyse par FACS des populations leucocytaires innées, appliquée à un modèle murin d'I/R.
MÉTHODES
Le modèle consiste en un clampage isolé de l'artère rénale gauche (30 min) avec néphrectomie droite concomitante (rein contrôle), suivi d'une période de reperfusion de 24 heures ou 7 jours et prélèvement du rein gauche (rein I/R). La dissociation tissulaire repose sur le Multi Tissue Dissociation Kit 1 (Miltenyi). L'analyse est réalisée sur cytomètre FACS LSR (BD) avec un panel de 8 marqueurs ciblant les leucocytes intra-rénaux. n = 8 par groupe. Les différences droite-gauche ont été évaluées par le test de Mann-Whitney, et la magnitude de l'effet est estimée selon le calcul du ratio des moyennes (RM).
RÉSULTATS
À 24 heures, l'I/R induit une infiltration neutrophilique majeure (RM=6,38 ; p<0.01). Les macrophages intermédiaires s'accumulent et basculent vers un phénotype pro-inflammatoire (ratio M1/M2 majoré : RM=1,79 ; p=0,01) avec sous-expression du CMH-II (RM=0,21 ; p<0.01). Les macrophages différenciés diminuent en nombre (RM=0,64 ; p=0,02), perdent en expression de CMH-II (RM=0,41 ; p<0.01) et sur-expriment CD64 (RM=1,36 ; p=0,03). À 7 jours, l'infiltration neutrophilique persiste (RM=3,65 ; p<0.01). Les macrophages intermédiaires se raréfient et conservent leur phénotype pro-inflammatoire (proportion [%] CD86+/CD206- majorée, RM=1,41 ; p=0,01). Les macrophages différenciés prennent eux une polarisation anti-inflammatoire (% CD86-/CD206+ augmenté, RM=2,17 ; p=0,03 ; ratio M1/M2 diminue, RM=0,53 ; p=0,04).
CONCLUSION
Ce travail fournit un protocole robuste d'analyse immunitaire du parenchyme rénal murin par FACS et confirme, dans un modèle d'I/R artérielle isolée, une réponse innée temporellement orchestrée : phase neutrophilique précoce, activation macrophagique pro-inflammatoire à 24 heures, et remodelage anti-inflammatoire progressif à 7 jours.
Research Center/Unit :
GIGA Cardiovascular Sciences-Laboratory of Translational Research in Nephrology - ULiège
Disciplines :
Urology & nephrology
Author, co-author :
Szedleski, Alexandre ; Université de Liège - ULiège > Département des sciences biomédicales et précliniques
Cytométrie en flux appliquée au parenchyme rénal murin : caractérisation dynamique de la réponse immunitaire innée à 24 heures et 7 jours après ischémie-reperfusion
Publication date :
09 September 2026
Number of pages :
1
Event name :
Congrès de la SFNDT 2026
Event organizer :
Société Francophone de Néphrologie Dialyse Transplantation
Event place :
Paris, France
Event date :
13-16/10/2026
Audience :
International
Funders :
F.R.S.-FNRS - Fonds de la Recherche Scientifique
Commentary :
***DETAILS METHODOLOGIQUES***
MODÈLE MURIN
Le modèle a été appliqué à deux groupes indépendants de souris C57BL/6J âgées de 8 à 12 semaines, un groupe par durée de reperfusion (24 heures et 7 jours), de 8 animaux chacun (4 mâles, 4 femelles), chaque animal fournissant son propre contrôle.
Après laparotomie médiane, le pédicule vasculaire rénal gauche est disséqué afin d'isoler l'artère rénale gauche, clampée isolément durant 30 minutes. La décoloration immédiate du rein confirme l'ischémie. Une néphrectomie droite, réalisée une minute après le retrait du clamp, fournit le rein contrôle apparié. Le rein ischémié est prélevé au terme de la durée de reperfusion du groupe.
Ce design apparié est le point fort du modèle : il annule la variabilité inter-individuelle et permet de travailler avec 8 animaux par groupe.
DISSOCIATION ET CYTOMÉTRIE
Le pôle rénal inférieur, conservé jusqu'à 48 heures en MACS Tissue Storage Solution (Miltenyi Biotec), est dissocié mécaniquement et enzymatiquement en suspension unicellulaire avec le Multi Tissue Dissociation Kit 1 (Miltenyi Biotec), selon un protocole optimisé pour le rendement cellulaire et la viabilité.
Acquisition sur FACS LSR (BD Biosciences), panel de huit marqueurs : viabilité, CD45, CD3/CD19, Ly6C, CD64, CMH-II, CD86 et CD206. La stratégie de sélection est illustrée en Figure 1 : isolation des leucocytes parmi les cellules viables, puis exclusion des lymphocytes et des neutrophiles. Le couple Ly6C/CD64 isole les trois stades du continuum mono-macrophagique, le couple CD86/CD206 témoigne de leur polarisation.
Protocole approuvé par le Comité d'éthique animale de l'ULiège (dossier n° 26-2728). Le détail complet de la méthodologie est accessible via le QR code.
ANALYSE STATISTIQUE
Chaque groupe est analysé séparément par test de Wilcoxon signé apparié, l'effet étant exprimé en ratio des moyennes rein ischémié sur rein contrôle, représenté en log2 (Figure 2). Une valeur positive traduit une augmentation dans le rein ischémié, 0 l'absence de différence, +1 un doublement. Ces p ne sont pas corrigées pour la multiplicité.
L'influence de la durée de reperfusion est testée sur l'interaction ischémie-reperfusion × durée, par ANOVA 2:2 à mesures répétées, avec correction de Benjamini-Hochberg sur les 28 paramètres analysés (Figure 3). ***INTERPRETATION DES RESULTATS***
24 HEURES : UNE PHASE DE RECRUTEMENT
Dans le rein ischémié comparé à son contrôle apparié, on observe une accumulation de macrophages intermédiaires dont la différenciation macrophagique reste peu avancée, comme en témoigne une MFI CMH-II abaissée. La proportion de cellules polarisées est faible dans les trois populations, au profit du phénotype CD86 négatif / CD206 négatif.
Autrement dit : à 24 heures, les cellules sont là, mais elles ne sont encore ni différenciées ni polarisées.
7 JOURS : MATURATION ET POLARISATION
À 7 jours, le tableau s'inverse terme pour terme. La proportion de macrophages intermédiaires se normalise et leur différenciation est plus avancée, avec une MFI CMH-II majorée. La proportion de cellules polarisées augmente dans les trois populations, avec une chute des CD86 négatif / CD206 négatif. Enfin, une surexpression de CD86 apparaît au sein des monocytes et des macrophages intermédiaires, au profit des phénotypes CD86+/CD206− et CD86+/CD206+, soit une orientation M1.
DÉPENDANCE À LA DURÉE (FIGURE 3)
Pour les paramètres du tableau, l'interaction ischémie-reperfusion × durée reste significative après correction pour la multiplicité (q < 0,05) : la réponse observée dépend bien du délai de reperfusion, et non du seul effet de l'ischémie.
Aucune interaction détectable sur la proportion de monocytes ni de macrophages différenciés parmi les mono-macrophages totaux, sur les MFI CD206 et CMH-II monocytaires, ni sur les MFI CD86 et CD206 des macrophages différenciés. L'interaction sur la MFI CD206 des macrophages intermédiaires n'atteint pas le seuil (q = 0,078).
