Abstract :
[en] Over billions of years of evolution, microbes have colonized nearly every corner of the biosphere. While long-term evolutionary adaptation explains their global success, thriving within a given niche often requires coping with short-term fluctuations. To optimize their fitness under such conditions, isogenic populations rely on phenotype adaptation and diversification. Although beneficial from an ecological perspective, the resulting phenotypic heterogeneity is generally undesirable in applications such as bioproduction, where it makes the process unpredictable and is presumed to contribute to instability and lower yields. Nowadays, microbial cell factories are increasingly employed for the sustainable production of target molecules. It is therefore crucial to better understand diversification dynamics and to develop strains, process designs, and control strategies that optimize microbial production.
Expanding on previous work from our team, we provide a deeper understanding of phenotypic diversification in continuous culture by addressing both its functionality and underlying mechanisms. Notably, we identified and described a fitness-entropy compensation (FEC) mechanism that offsets the activation of gene circuits that compromise survival. We also investigated and successfully applied the Segregostat, a real-time, flow-cytometry-based closed-loop control system, to regulate cell populations in a scale-down (SD) bioreactor mimicking the heterogeneous environmental conditions typical of industrial scale.
Throughout this thesis, we focused on the general stress response (GSR) to study and control phenotypic diversification. It constitutes a particularly relevant framework, as its activation entails trade-offs with growth due to resource redistribution, which influences diversification dynamics. In addition, the GSR represents an important target for bioprocess optimization. Using complementary single-cell approaches, i.e., flow cytometry (FC) and time-lapse microscopy in a microfluidic single-cell cultivation (MSCC) device, we investigated GSR dynamics and control under nutrient limitation in two of the most widely used model organisms, Escherichia coli and Saccharomyces cerevisiae.
Overall, our findings highlight that microbial populations, although expected to be homogeneous under chemostat conditions, are in fact shaped by continuous feedback between the cells and their environment, which influences their stability and phenotypic diversification. They also emphasize that aligning process conditions with the intrinsic dynamics of regulatory networks (for instance, through the use of the Segregostat) is key to maintaining cellular responsiveness and achieving homogeneous populations. These insights both advocate and pave the way for the development of more cell-centric strategies in bioprocess design and control.
[fr] Au cours de milliards d’années d’évolution, les microorganismes ont colonisé presque tous les recoins de la biosphère. Si l’adaptation évolutive à long terme explique leur succès global, survivre et prospérer dans une niche donnée requiert souvent de faire face à des fluctuations environnementales à court terme. Pour optimiser leur fitness dans de telles conditions, les populations isogéniques reposent sur l’adaptation et la diversification phénotypique. Bien que bénéfique d’un point de vue écologique, l’hétérogénéité phénotypique qui en résulte est généralement indésirable dans les applications de bioproduction, car elle rend les procédés imprévisibles et est susceptible d’engendrer de l’instabilité ainsi qu’une baisse des rendements. Aujourd’hui, les “usines cellulaires” microbiennes sont de plus en plus utilisées pour la production durable de molécules d’intérêt. Il est donc essentiel de mieux comprendre les dynamiques de diversification et de développer des souches, des procédés et des stratégies de contrôle capables d’optimiser la production microbienne.
Dans la continuité des travaux précédents de notre équipe, nous proposons une analyse approfondie de la diversification phénotypique en culture continue, en abordant à la fois sa fonctionnalité et ses mécanismes. Nous avons notamment identifié et décrit un mécanisme de compensation fitness-entropie (FEC), qui contrebalance l’activation de circuits géniques compromettant la survie cellulaire. Nous avons également étudié et appliqué avec succès le Segregostat, un système de contrôle en boucle fermée basé sur la cytométrie en flux, afin de réguler des populations cellulaires dans un bioréacteur scale-down (SD) reproduisant les conditions hétérogènes typiques des procédés industriels.
Tout au long de cette thèse, afin d’étudier et de contrôler la diversification phénotypique, nous nous sommes focalisés sur la réponse générale au stress (GSR). Ce système est particulièrement pertinent, car son activation met en jeu une balance physiologique entre la croissance et la résistance au stress, liée à la redistribution des ressources, influençant ainsi la dynamique de diversification. Par ailleurs, la GSR représente une cible importante pour l’optimisation des bioprocédés. En combinant des approches monocellulaires complémentaires (à savoir, de la cytométrie en flux (FC) et de la microscopie en temps réel dans un dispositif microfluidique de culture monocellulaire (MSCC)), nous avons étudié la dynamique et le contrôle de la GSR en condition de limitation nutritive chez deux organismes modèles parmi les plus utilisés, Escherichia coli et Saccharomyces cerevisiae.
Dans l’ensemble, nos résultats mettent en évidence que les populations microbiennes, bien qu’attendues homogènes dans des conditions de chémostat, sont en réalité façonnées par des rétroactions continues entre les cellules et leur environnement, ce qui influence leur stabilité et leur diversification phénotypique. Ils soulignent également que l’adaptation des conditions de culture aux dynamiques intrinsèques des réseaux de régulation et de l’expression des gènes (par exemple, via l’utilisation du Segregostat) est essentielle pour maintenir la réponse cellulaire et obtenir des populations homogènes. Ces travaux soulignent la nécessité d’adopter une approche davantage centrée sur la cellule dans la conception et le contrôle des bioprocédés.
