Prise en compte l'état de la membrane cellulaire sur la réponse de biocapteurs fluorescents pour la détection de défaut d'écoulement au niveau des bioréacteurs : vers une intégration du "sécrétome" dans la problématique de l'extrapolation

Malgré les nombreuses approches envisagées à ce jour, la dynamique du stress microbien en conditions de culture intensive (procédé fed-batch) est encore un aspect mal maîtrisé. Au cours de ce travail, deux biocapteurs microbiens basés sur le principe de la protéine fluorescente verte (Green Fluorescent Protein ou GFP) ont été mis en œuvre dans des réacteurs scale-down permettant de reproduire les défauts d'écoulement rencontrés dans les bioréacteurs industriels. Les promoteurs de stress associés à la synthèse de la GFP ont été choisis suivant leur sensibilité à la limitation en source de carbone, condition standard qui est rencontrée dans les processus fed-batch ou l'apport en substrat carboné est limité afin d'éviter des déviations du métabolisme microbien (promoteurs rpoS et csiE). Les résultats obtenus montrent clairement que l'exposition des biocapteurs à des hétérogénéités locales de substrat entraîne une diminution de l'expression de la GFP. L'intensité de fluorescence a été mesurée à l'échelle cellulaire par cytométrie en flux. Durant les cultures, une chute significative du niveau de GFP intracellulaire a été observée pour les deux conditions scale-down considérées et pour les deux types de promoteur. Cette chute de fluorescence peut être attribuée à des phénomènes de répression des promoteurs suite à la levée locale de la limitation en carbone, mais également au relargage de la GFP dans le milieu extracellulaire. Ce relargage a été observé dans toutes les conditions opératoires considérées, comme le montrent les analyses des surnageants de culture par SDS-PAGE. L'intensité du relargage est néanmoins plus forte dans les conditions standard de culture (c'est-à-dire dans des réacteurs classiques sans approche scale-down). En effet, la coloration par l'iodure de propidium des biocapteurs cultivés en conditions standards est plus élevée que dans les conditions scale-down, suggérant une perméabilité membranaire plus élevée. Ces résultats offrent des potentialités intéressantes pour l'analyse simultanée de la viabilité cellulaire et de la détection des défauts d'écoulement par l'emploi de biocapteurs microbiens. De plus, les analyses par SDS-PAGE ont montre une grande diversité de protéines relargée en cours de procédé. Cette observation est étonnante du fait de l'emploi de milieux minéraux définis dans toutes les conditions étudiées. L'analyse de ce sécrétome offre des potentialités intéressantes pour la caractérisation des conditions de stress encourues par les micro-organismes au cours des procédés.