Evolution de la viabilité cellulaire dans les procédés de production de ferments lactiques : effet du type de bactérie sur l'évaluation par cytométrie en flux

La cytométrie en flux est une technique permettant d'effectuer des analyses au niveau des cellules individuelles.
Cette technique a été développée à l'origine pour l'analyse de cellules animales dans des applications à finalité
médicale. Ce n'est que dans les années 90 que cette technique a été considérée dans le cadre des cellules
microbiennes procaryotes et eucaryotes. Grâce à l'évolution des technologies (laser à l'état solide, progrès dans la
maîtrise des micro-écoulements,…), plusieurs développeurs proposent actuellement des cytomètres en flux pour
des budgets abordables (environ 30.000 euros). Cette évolution entraîne actuellement un engouement des
industriels pour la mise en oeuvre de cette technique pour le suivi de l'évolution des populations microbiennes
dans divers procédés : brasserie, vinaigrerie, production de starters pour la boulangerie, production de starters
lactiques,… L'intérêt manifesté pour cette technique est simple à comprendre si on considère les techniques
actuelles pour l'estimation de la viabilité cellulaire. En effet, celles-ci reposent souvent sur la revification des
cellules sur milieu gélosé et comptage des colonies après un temps d'incubation. Le problème fondamental de
cette technique repose sur l'utilisation de conditions de culture qui ne sont pas forcément identiques à celle
rencontrée au niveau du processus de production. Ce phénomène entraîne une sous-estimation des cellules
microbiennes actives rassemblées sous le terme de "viables mais non cultivables". A cela s'ajoutent des
problèmes techniques imposés par le temps de remise en culture et l'obtention des résultats bien après que le
processus de production soit terminé, ainsi que par des procédures de laboratoire coûteuses en personnel et en
consommables. La cytométrie s'impose donc comme une technique de choix qui permet d'analyser les cellules
microbiennes individuelles sans étape de remise en culture et avec un débit expérimental élevé. En effet, 30.000
cellules peuvent être analysées en 30 secondes immédiatement après la prise d'échantillon, ce qui permet
éventuellement de corriger les conditions de procédés en fonction de l'état des micro-organismes. L'utilisation de
fluorochromes spécifiques permet l'analyse de caractéristiques cellulaires. Dans le cas des bactéries lactiques,
l'utilisation du couple de colorant "carboxyfluorescéine diacétate" / "iodure de propidium" (cFDA/PI) est mis en
oeuvre en routine pour la détermination de la viabilité cellulaire. L'iodure de propidium pénètre dans les cellules
ayant une membrane endommagée et les colore en rouge, tandis que le cFDA est un composé non fluorescent qui
diffuse au travers de toutes les membranes cellulaires et est hydrolysées par les activités estérases intracellulaires
pour donner un composé fluorescent vert. Ces deux composantes de fluorescence peuvent être facilement
caractérisées par analyse multi paramétrique au niveau d'un cytomètre en flux. La difficulté majeure que
rencontre l'application de la cytométrie en flux au niveau industriel réside dans l'interprétation des résultats. Dans
ce travail, trois souches de bactéries lactiques ayant des sensibilités différentes au stress de procédé ont été mise
en oeuvre dans des schémas de production industriels faisant intervenir les étapes suivantes : production en
bioréacteur agité de 2m³, récolte par centrifugation continue, congélation et lyophilisation. L'analyse par
cytométrie en flux montre des tendances fondamentalement différentes pour les trois types de micro-organismes.
Les deux souches microbiennes plus sensibles au stress de procédé du fait de leur caractère anaérobie strict ou
microaérophile montrent des sous-populations bien distinctes au niveau des cytogrammes, tandis que la souche
plus résistante ne montre qu'une seule population évoluant suivant les étapes du procédé. Ces observations sont
utilisées pour une meilleure interprétation des cytogrammes pour l'estimation de la viabilité cellulaire en conditions de procédé. Une meilleure interprétation peut également être obtenue en considérant la possibilité de relargage des produits de dégradation fluorescents provenant de l'hydrolyse du cFDA en fonction de l'état de la membrane cellulaire.