Abstract :
[en] Phenotypic heterogeneity provides the microbial population with fast adaptive response (i.e., in the range of several minutes) against various kinds of stress factors, mainly for improving the natural fitness of the microbial population in the presence of environmental fluctuations. The stability and reproducibility of such productive phenotype became more critical when applying continuous cultivation in industrial production. Here we report using a single-cell toolbox to study the impact of nutrient fluctuations on microbial population dynamics, and this platform can be used to ensure the long-term stability of phenotypic diversification.
The setup, design, and operation of the so-called segregostat combined with an automated sampling platform and online flow cytometry were developed in order to implement real-time analysis and feedback control with a very high time resolution. This closed-loop controller is able to drive phenotypic diversification employing defined pulse-frequency modulation within continuously running bioreactor setups. Two exemplary case studies have been discussed, i.e., phenotypic diversification dynamics based on outer membrane permeabilization and the response of a coherent feedforward loop motif in E. coli, highlighting the applicability and flexibility of the proposed approach.
In the first case, glucose pulses were added to maintain a predefined diversification ratio between non-permeablized and permeabilized cells based on an exogenous biomarker (propidium iodide). Our segregostat platform offered the possibility to adjust the environmental fluctuation profile based on the state of the population and automated this dynamic control in real-time. The second case study was focused on the induction of the arabinose operon as a model system; the GFP level prompted by an arabinose-inducible promoter has been tracked by flow cytometry. The bimodal distribution in the GFP expression pattern and the co-existence of GFP positive and negative subpopulations were observed in the glucose/arabinose co-feeding chemostat. Furthermore, adjusting the arabinose/glucose transitions based on the phenotypic switching under a bang-bang controller provides a fully predictable, but oscillatory, gene expression dynamics. Forcing the expression level of the arabinose system by increasing the inducer stimulation frequency led to harmonic oscillation, a more homogenous response of the cell population, and alleviated the bimodal behavior in gene expression. Such dynamic control could enable the repeated and reversible switching between two gene expression states, allowing individual cells to switch around a predefined threshold. Periodic inducer addition could be applied in bioprocesses for driving microbial population into a predefined phenotypic trajectory.
Taken altogether, these results pointed out that our control platform is a major step in quantitatively controlling phenotypic heterogeneity among microbial population.
[fr] L'hétérogénéité phénotypique fournit aux populations microbiennes une réponse adaptative rapide (c'est-à-dire dans la gamme de plusieurs minutes) contre divers types de facteurs de stress. Ceci a pour conséquence d’améliorer le fitness des populations microbiennes en présence de fluctuations environnementales. La stabilité et la reproductibilité de phénotype productif sont devenues plus critiques lors de l'application de la culture continue dans la production industrielle. Nous présentons ici l'élaboration et l’utilisation d'une boîte à outils basé sur des données unicellulaire pour étudier l'impact des fluctuations des nutriments sur la dynamique des populations microbiennes, et cette plateforme peut être utilisée pour assurer la stabilité à long terme de la diversification phénotypique.
L'installation, la conception et le fonctionnement de ce que l'on appelle le segregostat, combine une plateforme d'échantillonnage automatisée et à la cytométrie de flux en ligne, ont été développés afin de mettre en œuvre une analyse en temps réel et un contrôle par rétroaction avec une très haute résolution temporelle. Ce contrôleur est capable de piloter la diversification phénotypique en utilisant une modulation de fréquence d'impulsion. Deux cas ont été discutés, à savoir la dynamique de la diversification phénotypique basée sur la perméabilisation de la membrane externe et l’induction de l’operon arabinosechez E. coli, soulignant l'applicabilité et la flexibilité de l'approche proposée.
Dans le premier cas, des impulsions de glucose ont été ajoutées pour maintenir un ratio de diversification prédéfini entre les cellules non perméables et perméables, basé sur un biomarqueur exogène (iodure de propidium). Notre plateforme, le segregostat, offre la possibilité d'ajuster le profil de fluctuation environnementale en fonction de l'état de la population et automatise ce contrôle dynamique en temps réel. La deuxième étude de cas était axée sur l'induction de l'opéron arabinose en tant que système modèle ; le niveau de GFP déclenche par un promoteur inductible à l'arabinose a été suivi par cytométrie de flux. La distribution bimodale dans le modèle d'expression de la GFP et la coexistence de sous-populations positives et négatives de GFP ont été observées dans le chemostat de coalimentation glucose/arabinose. De plus, l'ajustement des transitions arabinose/glucose en fonction du changement phénotypique fournit une dynamique d'expression entièrement prévisible et oscillant. Forcer le niveau d'expression du système arabinose en diminuant la fréquence de stimulation de l'inducteur conduit à une oscillation harmonique et à une réponse plus homogène de la population cellulaire. L'ajout périodique d'inducteurs pourrait être appliqué dans les bioprocédés pour conduire la population microbienne dans une trajectoire phénotypique prédéfinie.
Dans l'ensemble, ces résultats montrent que notre plateforme de contrôle constitue une étape importante dans le contrôle quantitatif de l'hétérogénéité phénotypique des populations microbiennes.
