Abstract :
[en] G protein-coupled receptors (GPCRs) represent the protein family most successfully targeted for treating human diseases. They couple to G proteins to mobilize second messenger pathways that lead to cellular responses and ultimately to physiological changes. However many are poorly characterized with few ligands reported or remain completely orphans. Therefore, there is a growing need for screening-compatible and sensitive assays in order to identify new ligands.
The present project aims at developing pharmacological tools to characterize the pharmacology and physiology of GPCRs. Our approach rely on i) development of receptor models and assays for the identification of ligands, ii) screening of chemical and virtual small molecules libraries and iii) analysis of structure-activity relationships study of active molecules. The project has been divided in two parts.
To set-up assays for the evaluation of GPCRs activation, we selected the understudied succinate receptor 1 (SUCNR1) that is proposed to affect cellular metabolism and pathophysiology of diseases in multiple organs. Nevertheless the receptor has never been validated as a drug target because very few ligands have been described. So, developing pharmacological tools for SUCNR1 remains of great interest in therapeutic drug discovery.
First, we have started by examining SUCNR1 signaling pathways in HEK293 cells. Our investigations have highlighted the efficient coupling to Gαi and thus the negative modulation of intracellular cAMP levels. Consequently we have implemented an assay sensitive to cAMP variations to identify ligands able to induce SUCNR1 activation. However, an important drawback to track agonists for Gαi-coupled receptors is the mandatory stimulation of cAMP levels. Inducers such as forskolin must be used and are sources of variations and errors. In order to avoid these artifacts we have set-up and validated a cAMP-inducer free method based on the GloSensor biosensor. This real time assay was amenable to high-throughput screening for the detection of Gαi-coupled receptors agonists. The strategy monitoring basal cAMP levels compared to the stimulated cAMP levels allowed to decrease recording time and artifcats from forskolin use, leading to the identification of fewer false positives and unidentified false negatives. Although both methods found agonists in the chemical library screened, no active new scaffolds on SUCNR1 were discovered.
We infer that this method could facilitate the study and screening of Gαi-coupled receptors for active ligands.
Secondly, given the interesting potential of SUCNR1 for promising therapeutic advances, we have carried out the study of the receptor interaction with its natural ligand, succinate. We have optimized the previous three-dimensional model for SUCNR1 binding pocket by means of more detailed structure-activity relationships study of succinate related molecules. The study of structure-activity relationships performed by Pierre Geubelle, in parallel to this work, allowed the deduction of the structural elements required to be active on SUCNR1. Thus we have defined a pharmacophore for activity on the receptor and subsequently evaluated various cycloalkanes. With our cAMP assay, Pierre Geubelle has highlighted the (1R, 2S)-1,2-cyclopropanedicarboxylate to be able to activate SUCNR1. We confirmed the activity of this compound on SUCNR1 capacity to recruit arrestin 3 and determined the pharmacological properties of this new ligand as SUCNR1 agonist, in vitro and in vivo. To confirm our in vitro results, we have also assessed the hypertensive properties of this cyclic analogue. Intravenous addition at the dose of 0.1 mg.kg-1 in rats has been demonstrated to increase blood pressure in the same range as succinate.
Consequently we have demonstrated that (1R, 2S)-1,2-cyclopropanedicarboxylate could be regarded as an original synthetic full agonist for SUCNR1. In addition, the pharmacophore for SUCNR1 should help to generate synthetic compounds characterized by an increased potency and/or efficacy compared to succinate.
[fr] Les récepteurs couplés aux protéines G (RCPGs) constituent la plus grande famille de récepteurs membranaires intervenant dans la transduction des signaux extracellulaires. Via la régulation de messagers intracellulaires, ils sont responsables du contrôle de nombreuses fonctions physiologiques et sont la cible de nombreux médicaments commercialisés. Cependant, de nombreux RCPGs sont encore peu caractérisés avec peu de ligands décrits ou encore même orphelins. De ce fait, ils font l’objet de nombreuses études ayant pour but de déterminer leur(s) rôle(s) physiologique(s), mais également d’identifier leurs ligands afin de déterminer leur intérêt en tant que cibles pour la découverte de nouveaux médicaments. C’est pourquoi il y a un besoin croissant de disposer de tests pharmacologiques sensibles et compatibles avec le criblage de librairies afin d’identifier de nouveaux ligands.
Ce projet a pour but de développer des outils pharmacologiques pour caractériser la pharmacologie et la physiologie de tels récepteurs. Notre approche est basée sur i) le développement de modèles cellulaires et de tests pharmacologiques pour identifier des ligands, ii) le criblage de librairies chimiques et virtuelles, et iii) l’analyse des relations structure-activité des molécules actives. Le projet peut être divisé en deux parties.
Afin de développer des tests pharmacologiques et ainsi évaluer l’activation de RCPGs, nous avons sélectionné le récepteur au succinate, SUCNR1. Ce récepteur a été décrit comme affectant le métabolisme cellulaire ainsi que de nombreuses pathologies dans plusieurs organes. Il n’a toutefois jamais été validé comme cible thérapeutique. Ceci est dû au fait que peu de ligands ont été décrits. Le développement d’outils pharmacologiques pour SUCNR1 constitue donc un intérêt majeur en recherche thérapeutique.
D’abord, l’investigation des voies de signalisation de SUCNR1 surexprimé dans des cellules HEK293, nous a permis d’identifier le récepteur comme étant efficacement couplé à la protéine Gαi et donc capable de moduler négativement les taux d’AMPc intracellulaire. Par conséquent, nous avons mis au point un test pharmacologique capable de mesurer les variations d’AMPc pour identifier des ligands qui induisent l’activation de SUCNR1. Toutefois, l’identification d’agonistes de récepteurs couplés à Gαi nécessite la stimulation préalable des taux d’AMPc par un activateur tel que la forskoline. Leur utilisation est un grand inconvénient puisqu’ils génèrent de nombreuses variations et erreurs. Dans le but de s’affranchir de cette source d’erreurs, nous avons mis au point et validé une méthode qui rend possible la mesure des taux d’AMPc de base sans nécessiter l’utilisation d’un activateur. Le test pharmacologique est basé sur un biosenseur appelé GloSensor qui permet une mesure en temps réel des taux d’AMPc et est facilement adaptable au criblage à haut débit pour détecter des agonistes pour les récepteurs couplés à Gαi. Cette stratégie a dès lors permis de diminuer le temps de lecture ainsi que le nombre d’artéfacts liés à l’utilisation de la forskoline. En effet, la méthode sans activateur des taux d’AMPc a conduit à l’identification de moins de faux positifs mais a aussi permis de révéler des faux négatifs. Bien que les deux méthodes aient mené à l’identification d’agonistes, aucunes nouvelles structures actives sur SUCNR1 n’ont pu être découvertes.
L’intérêt de cette méthode reside dans le fait qu’elle facilitera l’étude et le criblage de récepteurs couplés à Gαi pour l’identification de ligands.
Ensuite, nous avons étudié l’interaction du récepteur avec son ligand naturel, le succinate. Nous avons optimisé le modèle tridimensionnel de la poche de liaison de SUCNR1 existant grâce à des informations obtenues lors de l’étude des relations structure-activité d’analogues du succinate menée par Pierre Geubelle. Son travail a permis de déduire les éléments structuraux importants pour l’activité sur SUCNR1. Dès lors nous avons pu en déduire un pharmacophore et nous avons investigué l’activité de cycloalcanes. Avec le système GloSensor, Pierre Geubelle a identifié un nouvel agoniste de SUCNR1, le (1R, 2S)-1,2-cyclopropanedicarboxylate. Son activité a été confirmée sur une deuxième voie de signalisation. En effet, il induit le recrutement de l’arrestine 3 via l’activation de SUCNR1. Nous avons ensuite investigué son activité in vivo et mesuré son effet hypertenseur. Le composé injecté par intraveineuse à la dose de 0.1 mg.kg-1 augmente la pression artérielle chez le rat dans le même ordre de grandeur que le succinate.
Par conséquent, nous avons identifié un agoniste plein synthétique et original pour SUCNR1. De plus, le pharmacophore devrait aider à générer de nouveaux ligands pour SUCNR1, plus puissants et/ ou efficaces par rapport au succinate.
