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Abstract :
[fr] A. CONTEXTE
Il est essentiel de disposer de méthodes analytiques harmonisées et fiables lors de l’analyse de
routine. Le but de celles-ci est d’obtenir des informations de façon à prendre des décisions importantes en ce qui concerne par exemple la conformité aux réglementations gouvernementales. Il est généralement accepté parmi les analystes qu’une interprétation correcte des résultats d’une mesure demande une estimation fiable de leur incertitude. L’incertitude est un paramètre de performance pour les résultats de mesures qui est fondamental si c’est résultats doivent être pouvoir comparés et si les utilisateurs veulent pouvoir s’y fier.
B. OBJECTIFS
Le but du projet a été de mettre au point des normes et recommandations pour l’estimation de l’incertitude de mesures analytiques obtenues à partir des méthodes appliquées dans l’industrie chimique, pharmaceutique et apparentée. Il a été principalement question de méthodes de chromatographie liquide ainsi que celles d’électrophorèse capillaire destinées à l’analyse des matières premières médicamenteuses, pour la bioanalyse de médicaments dans le cadre d’études pharmacocinétiques et au test de pureté énantiomérique des médicaments chiraux. En vue d’atteindre les objectifs du projet, les démarches suivantes ont été appliquées :
- Examen de la situation actuelle et principalement les deux approches différentes employées pour déterminer l’incertitude d’une mesure à savoir l’approche ISO communément appelée « bottom-up » et celle du Comité des Méthodes Analytiques communément appelée « top-down ».
- Etude de certains domaines d’application (études de cas) et de certains problèmes techniques, à savoir l’échantillonnage, le contrôle de qualité, la limite de détection et de quantification dans le but de définir des lignes directrices générales.
- Développement des recommandations générales incluant une approche par arbre décisionnel et proposition de procédures standardisées finalisées, aisées à mettre en oeuvre et d’un coût abordable.
- Incitation à la reconnaissance du bien-fondé des recommandations proposées.
C. CONCLUSION
Dans la première partie de ce projet, la collecte des matériels et des situations existantes ainsi que l’étude des thèmes particuliers ont été évaluées. L’approche « bottom-up » (aussi appelée « error-budget ») pour l’évaluation de l’incertitude a été examinée. Elle est effectuée en quatre étapes à savoir: spécification du mesurande, identification des sources d’incertitudes, quantification des composantes de l’incertitude pour chaque source potentielle d’incertitude identifiée à la deuxième étape et calcul de l’incertitude combinée. L’évaluation de l’incertitude basée sur l’estimation de la précision a été aussi examinée considérant les études intra-laboratoire aussi bien qu’inter-laboratoires. La seconde partie a concerné en la détermination pratique de l’incertitude d’un résultat analytique individuel obtenu à partir des études inter-laboratoires. Dans cet ordre, de nouvelles méthodes de chromatographie liquide (CL) et d’électrophorèse capillaire (EC) ont été développées, validées et appliquées pour l’analyse des substances médicamenteuses. Trois études inter-laboratoires ont été accomplies. Deux sont complètement terminées et la dernière est en cours. Les méthodes CL et EC développées ont été inclues dans les différents protocoles élaborés pour ces études.
La première étude inter-laboratoires traitant de l’analyse des échantillons de la phénoxyméthylpénicilline (Pen V) consiste en la semi-micro détermination de l’eau par la technique de Karl-Fischer et un test de chromatographie liquide pour la détermination de la 4-hydroxy phénoxyméthylpénicilline ainsi que les autres substances apparentées. Les deux méthodes ont été basées sur la monographie de la Pharmacopée Européenne. La première étude inter-laboratoires consistait aussi à la titration potentiométrique acide-base pour déterminer le contenu de la Pen V. L’étude a montré comment différents estimés de l’incertitude de mesures analytiques peuvent être déterminés et comment les résultats d’une étude inter-laboratoires peuvent être utilisés pour estimer l’incertitude des résultats futures d’un laboratoire analysant des échantillons similaires.
La seconde étude a été réalisée dans le but de valider une nouvelle méthode CL pour l’analyse de l’érythromycine. La reproductibilité de cette méthode a été examinée lors de l’étude inter-laboratoires. Tous les laboratoires ont obtenus des résultats adéquats au niveau de la sélectivité permettant ainsi de déterminer le contenu de l’érythromycine A et de toutes les autres substances apparentées identifiées. L’analyse de la variance (ANOVA), réalisées sur ces résultats, a démontré une bonne reproductibilité de la méthode. De ce fait, elle convient pour remplacer la méthode officielle de la Pharmacopée Européenne. Les résultats de validation peuvent être aussi utilisés par n’importe quel laboratoire qui voudrait effectuer une estimation de l’incertitude pour cette méthode.
Une autre étude inter-laboratoires relative au maléate de timolol a été proposée. Elle comprend la détermination du R-timolol et des autres substances apparentées par chromatographie liquide en phase normale. Une méthode CL pour la détermination du R-timolol, décrite dans la 4ème édition de la Pharmacopée Européenne, a été adaptée, validée et testée au niveau de la robustesse. Les résultats du test de la robustesse ont été utilisés pour l’estimation de l’incertitude.
Quant aux méthodes EC, deux études inter-laboratoires ont été proposées. La première consiste en l’analyse de la métacycline et la seconde au test de pureté énantiomérique du kétoprofène. Pour la première étude, des problèmes sérieux quant au transfert de la méthode en utilisant différents équipements ont été observés. Ces résultats n’ont pas permis une analyse statistique. D’autre part, une autre étude inter-laboratoires basée sur la méthode EC développée pour le kétoprofène a été proposée. Considérant les résultats obtenus avec la première étude, le test de robustesse s’est avéré nécessaire d’être réalisé pour la méthode EC du kétoprofène après avoir validé cette méthode.
D. APPORT DU PROJET DANS UN CONTEXTE D’APPUI AUX PROCESSUS DE NORMALISATION ET DE REGLEMENTATIONS TECHNIQUES
A la fin du projet, les résultats attendus ont été le développement d’une stratégie générale incluant une approche par arbre décisionnel et l’établissement des procédures standardisées. Ces procédures doivent être aisées à mettre en oeuvre et d’un coût abordable. Ainsi, un guide de recommandations a été préparé. Le réseau du projet tentera d’en obtenir l’acceptation dans le but de valoriser les résultats attendus.
Le réseau tentera aussi d’obtenir l’acceptation des recommandations au sein du groupe ISO et leur application dans la commission de la Pharmacopée Européenne.
Le réseau tentera d’initier une nouvelle commission de la “Société Française des Sciences Techniques” (SFSTP) sur l’“Harmonisation des procédures analytiques quantitatives”.
Finalement, la dernière activité concernera la définition et l’évaluation d’un guide de recommandations minimales pour la détermination de l’incertitude dans un laboratoire analytique et son évaluation dans les rapports analytiques.
[nl] A. ONDERZOEKSKADER
Voor routineanalysen is het essentieel te beschikken over betrouwbare analytische methoden. Het doel van vele analytische methoden is het verwerven van informatie zodat belangrijke beslissingen genomen kunnen worden, bijvoorbeeld inzake de naleving van overheidsvereisten. Het is algemeen aanvaard onder analysten dat een correcte interpretatie van experimentele resultaten een betrouwbare schatting van hun onzekerheid vereist. Onzekerheid is een primaire karakteristiek voor de kwaliteit van experimentele data die fundamenteel is om te verzekeren dat de resultaten vergeleken kunnen worden en om eindgebruikers toe te laten om op deze data te vertrouwen.
B. DOELSTELLINGEN
Het doel van dit project was het ontwikkelen van normen en richtlijnen voor de praktische schatting van de onzekerheid van analytische metingen verkregen via methoden die gebruikt worden in de chemische, farmaceutische en verwante industrieën. Het betreft voornamelijk vloeistofchromatografische (LC) en capillaire electroforetische (CE) methoden voor de analyse van farmaceutische bulkprodukten, voor de bioanalyse van geneesmiddelen in het kader van farmacokinetische studies en voor zuiverheidstesten m.b.t. enatiomeren voor chirale geneesmiddelen.
Teneinde de doelstellingen van dit project te verwezenlijken, gebruikte het netwerk de volgende strategie:
- Eerst en vooral werd de bestaande situatie bestudeerd en in het bijzonder de twee benaderingen die gebruikt worden om de onzekerheid op een meting te bepalen, namelijk de ISO benadering die algemeen gekend is als “bottom-up” en de Analytical Method Committee benadering, ook “top-down approach” genoemd.
- Ten tweede werden enkele toepassingsgebieden onderzocht tesamen met een paar technische problemen zoals staalname, kwaliteitscontrole, detectie- en kwantificatielimieten, teneinde algemene richtlijnen te definiëren.
- Ten derde werden algemene richtlijnen, met inbegrip van een “menu-driven” benadering, en afgewerkte standaardprocedures ontwikkeld. Deze procedures zouden praktisch en rendabel moeten zijn.
- Tenslotte zal het netwerk proberen om de aanvaarding van de voorgestelde documenten te verkrijgen.
C. CONCLUSIES
In dit project werd in het eerste gedeelte het materiaal en de bestaande situaties verzameld, alsook werden de specifieke thema’s geëvalueerd. De bottom-up benadering (ook error-budget benadering genoemd) voor het evalueren van onzekerheid werd onderzocht en bestond uit vier stappen: de specificatie van de te meten component, de identificatie van bronnen van onzekerheid, de kwantificatie van de onzekerheidscomponenten voor elk van de in stap 2 geïdentificeerde mogelijke bronnen van onzekerheid en de berekening van de gecombineerde onzekerheid. De onzekerheidsevaluatie gebaseerd op de schatting van de precisie werd tevens bestudeerd via zowel intra- als interlaboratoriumstudies. Het tweede deel betrof de practische schatting van onzekerheid van een individueel analytisch resultaat verkregen door een interlaboratoriumstudie. In deze context werden enkele nieuwe vloeistofchromatografische (LC) en capillaire electroforetische (CE) methoden voor de analyse van geneesmiddelen ontwikkeld, gevalideerd en toegepast. Drie interlaboratoriumstudies werden uitgevoerd. Twee van de studies werden met succes beëindigd, terwijl de andere bijna afgelopen is. De ontwikkelde LC en CE methoden werden opgenomen in de verschillende protocols die opgesteld werden voor deze studies.
De eerste interlaboratoriumstudie, omtrent de analyse van een fenoxymethylpenicilline (Pen V) staal bestond uit een Karl-Fischer semi-micro bepaling van water en een vloeistofchromatografische test voor de bepaling van 4-hydroxyphenoxymethylpenicilline en andere gerelateerde onzuiverheden. De twee methoden zijn gebaseerd op de monografie van de Europese Farmacopee. De eerste studie bestond tevens uit een potentiometrische zuur-base titratie voor de gehaltebepaling van Pen V. De studie toonde aan hoe verschillende schattingen van de onzekerheid van analytische metingen bepaald kunnen worden en hoe de resultaten van een interlaboratoriumstudie gebruikt kunnen worden voor de schatting van de onzekerheid op toekomstige resultaten bepaald door een individueel laboratorium voor analoge stalen.
De tweede interlaboratoriumstudie werd uitgevoerd om een nieuwe LC methode te valideren voor de analyse van erythromycine. De reproduceerbaarheid van deze methode werd bestudeerd in een interlaboratoriumstudie. Alle labo’s verkregen een adequate selectiviteit om de gehaltebepaling van erythromycin A en alle geïdentificeerde gerelateerde substanties toe te laten. De variantie-analyse (ANOVA), uitgevoerd op deze resultaten, toonde de goede reproduceerbaarheid van de methode aan. De methode is geschikt om de bestaande officiële methode van de Europeese Farmacopee te vervangen. De resultaten van de validatie kunnen tevens gebruikt worden door elk labo dat een onzekerheidsbepaling wil doen voor deze methode.
Een bijkomende interlaboratoriumstudie betreffende de chirale scheiding van timololmaleaat werd voorgesteld. Ze bestond uit de bepaling van R-timolol en andere gerelateerde substanties door middel van vloeistofchromatografie in normaalfase modus. Een LC methode voor de bepaling van R-timolol, beschreven in de 4de editie van de Europeese Farmacopee werd aangepast, gevalideerd en getest op robuustheid. De resultaten van de robuustheidstest werden gebruikt voor de onzekerheidsbepaling.
Wat de CE methoden betreft, werden twee interlaboratoriumstudies voorgesteld. De eerste betreft de analyse van metacycline en de tweede de enantiomeren-zuiverheidstest van ketoprofen. Voor de eerste CE studie werden ernstige methode-transferproblemen vastgesteld bij gebruik van verschillende apparatuur. De resultaten lieten geen statistische analyse toe. Anderzijds werd een tweede interlaboratoriumstudie gebaseerd op CE methodeontwikkeling voor ketoprofen voorgesteld. Rekening houdend met de resultaten verkregen in de eerste CE studie, werd het nodig geacht om een robuustheidstest uit te voeren voor de CE methode op ketoprofen na de validatie van de methode.
D. BIJDRAGE VAN HET PROJECT MET BETREKKING TOT DE ONDERSTEUNING VAN HET STANDAARDISATIEPROCES EN TECHNISCHE REGELGEVINGEN
De verwachte resultaten bij het einde van het project waren de ontwikkeling van een algemene strategie, inclusief een “menu-gedreven” benadering, en de definitie van standaardprocedures, die praktisch en rendabel zouden moeten zijn. Daarom werd een voorstel van richtlijn gemaakt. Het netwerk van het project zal proberen aanvaarding te verkrijgen om de resultaten te valoriseren.
Het netwerk zal tevens proberen om de aanvaarding van de klad richtlijnen in de ISO groep te verkrijgen alsook hun toepassing in de Europese Farmacopeecommissie.
Het netwerk zal proberen een nieuwe commissie samen te stellen van de “Société Française des Sciences Techniques” (SFSTP) omtrent “Harmonization of quantitative analytical procedures”.
Tenslotte bestond de laatste activiteit uit de definitie en bepaling van een set van minimale richtlijnen voor de bepaling van onzekerheid in een analytisch laboratorium en hun rapportering in analytische rapporten.
Er werden internationale samenwerkingen gerealiseerd met de farmaceutische en chemische industrie alsook met universitaire laboratoria.
E. SLEUTELWOORDEN
- Onzekerheidsschatting
- Vloeistofchromatografische methoden
- Capillaire electroforetische methoden
- Interlaboratoriumstudies
- Validatie
- Robuustheid
- Richtlijnen
