Abstract :
[en] Pseudomonas aeruginosa is a Gram-negative opportunistic pathogen responsible for severe infections in immunocompromised and vulnerable patients. This microorganism is characterized by a marked intrinsic resistance to antibiotics, mediated by the constitutive expression of β-lactamases and efflux pumps, combined with the lack of large, non-specific porins, that renders its outer membrane poorly permeable to antibiotics.
In addition to this intrinsic resistance, P. aeruginosa can further acquire resistance to the limited therapeutic options available, either through the acquisition of exogenous resistance determinants, such as plasmid-encoded β-lactamases, or through the overexpression of endogenous systems, including efflux pumps and the chromosomally encoded β-lactamase AmpC. Furthermore, resistance to imipenem (and a general decrease in susceptibility to carbapenems) is a well- established fact in the literature and results from the loss of OprD porin expression. This association is explained by the structural similarity between arginine, the natural substrate of OprD, and the side chain of imipenem. To date, available studies investigating the role of other porins in the permeation of β-lactams have been scarce and fragmented.
In this study, we refined a previously described methodology designed to measure the periplasmic entry of β-lactam antibiotics by expressing BlaR-CTD, a high-affinity sensor for these antibiotics, in the periplasmic space. The results are summarized as follows.
First of all, this approach allowed us to evaluate the outer membrane permeability of the wild-type P. aeruginosa PAO1 strain and of several mutant strains lacking one or more porins. The comparison between PAO1 and an isogenic oprD-deficient mutant demonstrated that phenotypic variations in carbapenem susceptibility, with the exception of imipenem, were not correlated with a decreased rate of periplasmic entry. A reduction in the entry rate of other carbapenems was only observed in a strain simultaneously deleted for both oprD and opdP, thus defining the synergistic contribution of these two porins in the uptake of meropenem and biapenem.
Secondly, to further confirm the involvement of OpdP in antibiotic resistance, we assessed its increased expression in response to OprD loss. Additionally, we showed that the single deletion of opdP, which does not affect MIC values or permeability coefficients compared to wild-type PAO1, can nonetheless favor the selection of carbapenem-resistant strains in the presence of sub-inhibitory concentrations of meropenem. While the so derived resistance is typically mediated by mutations in oprD, we also identified a previously unreported mechanism of negative regulation of OprD expression.
Finally, as previously documented, multiple lineages of PAO1 exist. Unexpectedly, in our case, some of these lineages, although never directly utilized in our experiments, carried a mutation leading to the overexpression of OpdP.
All these results significantly advanced our understanding of the function of OpdP, a key porin for carbapenems uptake whose role had so far remained unclear.
[fr] Pseudomonas aeruginosa est une bactérie à Gram-négatif pouvant provoquer de graves complications chez les patients fragiles. Elle se caractérise par une résistance intrinsèque marquée aux antibiotiques, médiée par l’expression constitutive de β-lactamases et de pompes d’efflux, ainsi que par l’absence d’expression de larges porines non spécifiques, ce qui rend sa membrane externe faiblement perméable aux antibiotiques.
En outre, cette bactérie peut développer des résistances aux rares options thérapeutiques disponibles, soit par l’acquisition de déterminants de résistance exogènes, tels que des β-lactamases plasmidiques, soit par la surexpression de systèmes constitutifs comme les pompes d’efflux ou la β- lactamase AmpC. De plus, la résistance à l’imipénème (et la diminution générale de la sensibilité aux carbapénèmes) est bien documentée et résulte de l’absence d’expression de la porine OprD. Cette association est due à la similarité structurale entre l’arginine, substrat naturel de cette porine, et la chaîne latérale de l’imipénème. Les études disponibles dans la littérature concernant le rôle d’autres porines dans la perméation des β-lactamines étaient jusqu’à présent rares et fragmentaires. Dans ce travail, nous avons affiné une méthodologie précédemment décrite permettant de mesurer l’entrée d’un β-lactamine dans le périplasme par la production dans ce compartiment cellulaire du BlaR-CTD, un senseur à haute affinité pour ces antibiotiques.
En premier lieu, nous avons ainsi déterminé la perméabilité de la membrane externe de la souche sauvage P. aeruginosa PAO1 et de différents mutants délétés pour une ou plusieurs porines.
La comparaison entre PAO1 et un mutant isogénique délété de la porine oprD a montré que les variations phénotypiques de sensibilité aux carbapénèmes, à l’exception de l’imipénème, n’étaient pas corrélées à un ralentissement de la vitesse d’entrée dans le périplasme. Pour observer un ralentissement dans l’entrée d’autres carbapénèmes, il était nécessaire de considérer une souche délétée simultanément des gènes oprD et opdP, définissant ainsi le rôle synergique de ces deux porines dans la pénétration du méropénème et du biapénème.
En second lieu, pour corroborer l’implication d’OpdP dans la résistance aux antibiotiques, nous avons vérifié l’augmentation de son expression en réponse à l’absence d’OprD. Par ailleurs, nous avons montré que la délétion unique d’opdP, qui n’entraîne aucune variation ni de la CMI ni du coefficient de perméabilité en comparaison de la souche sauvage PAO1, peut néanmoins favoriser la sélection de souches résistantes aux carbapénèmes en présence de concentrations sous-inhibitrices de méropénème. La résistance qui en résulte est généralement médiée par des mutations dans le gène oprD, mais nous avons également mis en évidence un mécanisme inédit de régulation négative de la porine OprD.
En dernier lieu, nous avons aussi constaté l’existence de plusieurs lignées de PAO1 (un fait bien connu). De façon inattendue certaines d’entre elles (qui n’ont jamais été utilisées directement dans nos expériences) présentaient une mutation provoquant une surexpression d’OpdP.
Dans l’ensemble, ce travail a permis de faire progresser de manière significative la compréhension de la fonction d’OpdP, une porine clé dans l’absorption des carbapénèmes, dont le rôle restait jusqu’ici mal défini.
