Dosage de biomarqueurs dans les fluides biologiques par chromatographie liquide ou électrophorèse capillaire couplée à la spectrométrie de masse

La découverte, la caractérisation et le dosage de biomarqueurs ont permis d’ouvrir denouveaux horizons tant en thérapeutique que dans l’établissement d’une médecinepersonnalisée. Dans un contexte d’analyse en milieu complexe, l’application detechniques fiables, sensibles, exactes et de haute résolution est de rigueur. Dans ce but,le couplage de la spectrométrie de masse à une technique séparative telle que lachromatographie liquide (LC-MS) ou l’électrophorèse capillaire (CE-MS) offre despotentialités intéressantes.Une méthode de dosage de la cysdopa, un marqueur du mélanome, dans leplasma par LC-MS a été mise au point. Une étape préliminaire d’extraction en phasesolide sur un support hybride alliant des interactions de type hydrophobe, hydrophile etéchangeurs de cations a conduit à l’obtention d’excellents taux de récupération. Lesconditions chromatographiques assurant la séparation de la cysdopa des composésendogènes susceptibles d’interférer et les paramètres de la détection par spectrométriede masse en tandem ont été optimisés. La présence d’éventuels effets de la matrice aété investiguée en détails. Une étude de la stabilité de la cysdopa dans les différentesconditions opératoires a été réalisée répondant ainsi aux normes préscrites par la FDA.Ensuite, une validation complète de la méthode en milieu plasmatique selon l’approchefaisant appel aux profils d’exactitude sur une gamme de concentration allant de 1,6 à200 ng/ml a été menée avec succès démontrant l’adéquation de la méthode. Enfin, uneétude pilote ainsi qu’une validation en cours d’étude ont permis de tester cette méthodede dosage.La seconde technique mise en oeuvre consiste en l’application du couplage CE-MSà l’analyse de l’hepcidine, un petit peptide régulant le métabolisme du fer. Les conditionsélectrophorétiques assurant la séparation de ce peptide des constituants d’un mélangetype ont été déterminées. Le traitement de la paroi interne du capillaire et l’additiond’une cyclodextrine n’ont pas permis dans la présente application d’améliorer lasélectivité et l’efficacité des pics. L’utilisation d’un électrolyte de haute force ioniqueassocié à l’addition d’un modificateur organique a par contre offert les meilleuresperformances. Une approche multivariée en deux temps (criblage puis modélisation) aété appliquée pour l’optimisation des paramètres CE-MS. Les effets principaux du voltagedu capillaire et de la pression du gaz nébulisant se sont révélés être significatifs toutcomme l’effet quadratique de ce dernier ainsi que les interactions entre la concentrationen électrolyte et le voltage du capillaire d’une part et la pression du gaz nébulisantd’autre part. Finalement, la sensibilité en terme de rapport signal/bruit a été comparéeen CE-UV et CE-MS établissant les potentialités du couplage CE-MS pour l’analyse depeptides.Discovery, caracterization and determination of biomarkers provide newperspectives in therapeutics and establishment of personnal medecine. Analysis incomplex matrix requires reliable, sensitive, accurate and high resolution techniques. Toachieve this, coupling of mass spectrometry with separative techniques such as liquidchromatography (LC-MS) or capillary electrophoresis (CE-MS) offer interestingpotentialities.A method for the determination of cysdopa, a melanoma biomarker, in humanplasma was developed using LC-MS. Solid phase extraction in mixed mode, combininghydrophobic, hydrophilic and cation exchange interactions led to excellent recovery. Thechromatographic conditions ensuring separation of cysdopa from potential by interferingendogenous compounds and tandem mass spectrometry detection parameters wereoptimised. The presence of matrix effect was investigated in detail. A full stability studywas then performed according to FDA requirements. Finally, a complete validation of themethod in plasma following the approach of accuracy profiles over a concentration rangefrom 1,6 to 200 ng/ml was successfully performed, demonstrating adequacy of thedeveloped method. A pilot study and an in-study validation were finally perfomed to testthis assay method.The second implemented technique consists in the application of CE-MS couplingto hepcidin analysis, a small peptide regulating iron metabolism. Electrophoreticconditions ensuring separation of hepcidin from model peptides have been determined.Resolution and/or efficiency were not improved by using coated capillaries or by adding acyclodextrin. A high ionic strength electrolyte associated to the addition of an organicmodifier provided the best performance. A multivariate approach (screening andmodeling) was applied to the optimisation of CE-MS parameters. The principal effet ofcapillary voltage and nebulizing gas pressure were significant as well as the quadraticeffet of the last parameter and the interactions of electrolyte concentration and, for onepart, capillary voltage and, for another part, nebulizing gas pressure. Finally, sensitivitywith respect to signal/noise ratio was compared between CE-UV and CE-MS, assessingpotentialities of CE-MS for peptide analysis.