Abstract :
[en] The role of glycans in biological processes has raised awareness of oligosaccharides and glycoconjugates as important therapeutic targets for a wide range of diseases. Despite the technological advancement over the last decades, the diversity and complexity of these glycans remain a major challenge to their production. In nature, the synthesis of glycans is generally attributed to glycosyltransferases (GTs), which carry out the formation of most glycosidic bonds. Their use on an industrial scale, however, is limited because they are often difficult to produce and require activated sugars as substrates. Although glycoside hydrolases (GHs) are generally associated with the hydrolysis of plant biomass, some of them are also able to catalyze the synthesis of glycosidic bonds from simple saccharides via transglycosylation.
The ability of GHs to transglycosylate has aroused interest in glycan synthesis as these enzymes are abundant and cover a wide range of substrate specificity. The overall mechanism of transglycosylation is well known and follows the same reaction scheme as hydrolysis. After a first step called glycosylation, the donor sugar is covalently bound to the enzyme. Transglycosylation occurs when a hydroxyl group of an acceptor sugar is used instead of a water molecule in the deglycosylation step. Most transglycosylating GHs can therefore perform both reactions, but their transglycosylation yield is reduced since the newly formed products are concomitantly hydrolyzed.
Although knowledge about transglycosylating GHs is still increasing, there is no unique strategy to direct to transglycosylation yield. Thus, obtaining efficient enzymatic tools for glycan synthesis using GHs remains dependent on a better understanding of the molecular factors controlling the balance between hydrolysis and transglycosylation. This work aims to show such factors through the enzymatic and structural study of RBcel1, a family 5 GH endowed with transglycosylase activity.
The main goal of this work is to perform an in-depth study of the catalytic mechanism in RBcel1 via the identification of residues involved in catalysis as well as in substrate binding. Several variants of the enzyme were characterized to understand the roles attributed to different residues of the active site, in both catalysis and transglycosylation. The structural study of these variants allowed to obtain the structure of different reaction intermediates allowing to identify residues involved in the binding of substrate and, potentially, transglycosylation.
The results obtained in this work confirm partly some widely known mechanistic elements. They also highlighted new elements in the catalytic mechanism such as the key role of the non-catalytic residue tyrosine 201 in glycosylation and deglycosylation. Furthermore, this study presents a novel method to trap reaction intermediates in the presence of natural substrates while maintaining the catalytic residues. Different elements influencing transglycosylation have been highlighted, such as the size of the acceptor sugar or the reaction medium pH. The latter offers interesting perspectives for orienting the reaction towards transglycosylation since transglycosylation products tend to accumulate at basic pH.
[fr] La prise de conscience du rôle des glycanes dans les processus biologiques a fait des oligosaccharides et glycoconjugués des cibles thérapeutiques importantes pour un grand nombre de maladies. Malgré les avancées technologiques pour leur synthèse ces dernières décennies, la diversité et la complexité de ces oses font perdurer un défi important envers leur production. Dans la nature, la synthèse des glycanes est généralement attribuée aux glycosyltransférases (GTs), réalisant la formation de la plupart des liaisons glycosidiques. Cependant, leur utilisation à l’échelle industrielle est limitée car elles sont souvent difficiles à produire et nécessitent des oses activés comme substrats. Bien que les glycosides hydrolases (GHs) soient généralement associées à l’hydrolyse de la biomasse végétale, certaines d’entre elles sont également capables de catalyser la synthèse de liaisons glycosidiques à partir de saccharides simples via une activité dite de « transglycosylation ».
La capacité des GHs à transglycosyler a suscité un intérêt pour la synthèse de glycanes tant ces enzymes sont abondantes et couvrent une large gamme de spécificités de substrats. Le mécanisme global de la transglycosylation est bien connu et suit le même schéma réactionnel que celui de l’hydrolyse. Après une première étape appelée glycosylation, l’ose donneur est lié de manière covalente à l'enzyme. La transglycosylation se produit lorsqu'un groupe hydroxyle d’un ose accepteur est utilisé au lieu d'une molécule d'eau lors de l'étape de déglycosylation. La plupart des GHs transglycosylantes peuvent donc effectuer les deux réactions, impactant leur rendement de transglycosylation suite à l’hydrolyse sous-jacente des produits nouvellement formés.
Bien que les études cherchant à comprendre ce qui, chez certaines enzymes, favorise la transglycosylation se multiplient et apportent de nombreux éclaircissements, elles mettent principalement en évidence qu’il n’existe pas de stratégie unique au sein des GHs permettant d’orienter la réaction en faveur de la transglycosylation. L’obtention d’outils enzymatiques performants pour la synthèse enzymatique à partir de GHs reste donc dépendante de la diversification des connaissances à propos des facteurs moléculaires orientant la réaction vers l’hydrolyse ou la transglycosylation. Ce travail s’inscrit dans cette démarche à travers l’étude enzymatique et structurale de RBcel1, une GH de la famille 5 dotée de l’activité transglycosylase.
Le but principal de ce travail est d’effectuer une étude approfondie du mécanisme catalytique chez RBcel1 via l’identification de résidus impliqués dans la catalyse ainsi que dans la liaison au substrat. Plusieurs variants de l’enzyme ont été caractérisés afin de comprendre les rôles attribués à différents résidus du site actif, tant au niveau général de la catalyse qu’au niveau de la transglycosylation. Leur étude structurale a permis d’obtenir la structure de différents intermédiaires de réaction permettant l’identification des résidus impliqués dans la liaison des oses et, potentiellement, la transglycosylation.
Les résultats obtenus dans ce travail confortent, en partie, certains éléments mécanistiques largement connus. Ils soulèvent également des éléments nouveaux au niveau du mécanisme catalytique comme le rôle clé du résidu non-catalytique tyrosine 201 dans la glycosylation et la déglycosylation. De plus, ce travail présente une méthode novatrice permettant de piéger des intermédiaires de réaction en présence de substrats naturels tout en maintenant les résidus catalytiques. Différents éléments influençant la transglycosylation ont été soulignés, comme la taille de l’ose accepteur ou le pH du milieu de réaction. Ce dernier point offre d’ailleurs des perspectives intéressantes pour l’orientation de la réaction en faveur de l’hydrolyse étant donné qu’il a mis en évidence une accumulation de produits de transglycosylation à certains pH.
