Abstract :
[en] Glycosylation plays a key role in the biological activity of recombinant antibodies (Ab) and their oligosaccharide profile depends on culture conditions. In order to optimize the long term production of monoclonal antibodies in cells grown in serum-free medium and to obtain conform products, characterization of glycosylation from these proteins is needed. The monitoring of this parameter ensures maximum production while maintaining the characteristics of the protein produced. Indeed, changes in glycosylation profile can induce a lack of antigen recognition or an inappropriate host response.
In this context, four chemically defined media have been chosen to produce recombinant antibodies. The amount of serum in each culture medium has been decreased progressively to allow adaptation of cells to serum-free conditions. The goal of this study is the analysis of potential changes in the glycosylation profile of antibodies resulting from both the adaptation process of the cells to their serum-free medium and the cell culture age. Data were collected on mouse and human antibodies, respectively.
The first approach was to study the whole protein (here the heavy chains of Ab) by ESI-Q-TOF in order to quickly determine the profiles of glycosylation. Subsequently, we focused the experiments on some samples to determine more precisely the structures of the glycans. In this case, the glycans were extracted, permethylated and then analyzed by MALDI-TOF. Experiences of MS/MS were also allowed to highlight some of these structures. Finally, the location of the glycosylated part of protein was performed using mass spectrometry in tandem CID-ETD.
By combining the currently available results, it appears that, in our cell culture conditions, the glycosylation of antibodies produced in serum-free media is generally close to that obtained for proteins produced in the media containing serum. The main species are indeed identical. In addition, fucosylation is stable in the different samples analyzed (80 to 90% of the glycans contain a fucose). Nevertheless, some differences may appear on the presence and/or the nature of sialic acids found. Regarding the location of the glycosylated parts, the results show that there is only one site on the glycans and that it remains the same in the different conditions tested.
[fr] Les chaines glycosylées jouent un rôle important dans l’activité biologique des anticorps (Ac) produits de manière recombinante et leur profil oligosaccharidique est dépendant des conditions de culture. Afin d’optimaliser la production de longue durée d’anticorps monoclonaux dans des cellules cultivées en milieu sans sérum et d’obtenir des produits conformes, il est important de caractériser la glycosylation de ces protéines par rapport aux protéines natives, et cela en fonction du milieu utilisé et de la durée des cultures. Le suivi de ce paramètre permet d’assurer une production maximale tout en conservant les caractéristiques de la protéine produite, un mauvais profil de glycosylation pouvant engendrer une absence de reconnaissance de l’antigène.
Dans ce contexte, quatre milieux chimiquement définis ont été choisis pour tester la production de ces protéines. La part de sérum dans le milieu de culture a été diminuée progressivement afin de permettre l’adaptation des cellules à un milieu sans sérum. Notre étude porte sur l’analyse de changements potentiels dans le profil de glycosylation intervenant au cours de ce processus d’adaptation.
La première approche a consisté à étudier les protéines entières (ici les chaines lourdes des Ac) par ESI-Q-TOF afin d’obtenir rapidement les profils de glycosylation présents. Par la suite, nous nous sommes focalisés sur certains milieux afin de déterminer plus précisément les structures des glycanes présents. Dans ce cas, les glycanes ont été extraits, perméthylés puis analysés par MALDI-TOF. Des expériences de MS/MS ont de plus permis de mettre en évidence certaines structures présentes. Enfin, la localisation de la partie glycosylée au sein de la protéine a été réalisée à l’aide de la spectrométrie de masse en tandem CID-ETD.
En combinant les premiers résultats obtenus, il apparait que la glycosylation des protéines produites grâce aux milieux sans sérum est globalement proche de celle obtenue pour les protéines produite de manière traditionnelle. Les espèces principales sont en effet identiques. De plus, la fucosylation est stable dans les différents échantillons analysés (80 à 90% des glycanes contiennent un fucose). Néanmoins, certaines différences peuvent apparaître concernant la présence et/ou la nature des acides sialiques rétrouvés. En ce qui concerne la localisation des parties glycosylées, les résultats obtenus montrent qu’il n’y a qu’un seul site portant les glycanes et que celui-ci reste identique dans les différentes conditions testées.
