Abstract :
[en] The Endoplasmic Reticulum (ER) membrane forms a dynamic network of tubules and sheets that is under continuous remodeling, reflecting its critical role for important cell biological functions. ER morphology is crucial for many cellular functions, including protein synthesis, post-translational protein modification, lipid synthesis, regulation of Ca2+ homeostasis and secretion. Glycosylation is one of the most common post- or co- translational modification of proteins, affecting the structure, function, stability, trafficking and even receptor recognition. In most cases membrane bound or secreted proteins are glycosylated with N- or O-linked glycans. Proteoglycans (PGs) in addition to containing canonical N- and O-glycans, are characterized by the presence of long sugar repeats attached via O-linked glycosylation motifs. Exostosin-1 (EXT1) glycosyltransferase is responsible for the chain elongation step of Heparan Sulfate (HS) PGs biosynthesis.
The quantitative and qualitative contributions of glycans attached to intracellular membrane proteins remains a challenge. The aim of this thesis is to address this question by examining the role of EXT1 in the relationship of ER morphology and its functionality.
In this study, we showed how the ER structure, morphology and dynamics are regulated by EXT1. We demonstrated that knockdown of EXT1 in mammalian culture cells and murine peripheral CD4+ T-cells results in an extended ER tubular structure, influencing the luminal ER mass density and causing disruption of Golgi morphology as revealed by transmission electron microscopy and structural modeling of the characteristic ER polygonal network. Moreover, EXT1 knockdown affected the secretory pathway as evidenced by several reporter assays in vitro and in vivo. This finding was supported by quantitative proteomic analysis that was performed in HeLa cells. A metabolomics approach indicated a higher de novo synthesis and consumption rate of nucleotides necessary for the synthesis of sugar intermediates such as UDP-hexoses and UDP-GlcNAc. Furthermore, we performed ER membrane glycoproteome analysis that revealed a shift towards complex N-glycan of higher molecular size in EXT1 knockdown. Thus, EXT1 has a new fundamental role in ER and Golgi morphogenesis and dynamics and is required for the ER-to-Golgi trafficking and secretion that could be coupled with post-translational glycosylation of membrane proteins.
Depletion of EXT1 reduces N-glycosylation levels, possibly by controlling the stability of the oligosaccharyltransferase complex. However, it favors the formation of higher molecular weight N-glycans, and increase of O-glycosylation of membrane proteins, which generates forces able to bend the intracellular membranes. Our study suggests that glycosylation changes represent a novel fundamental dimension to ER function and we recommend a systematic approach in the ER-proteome-glycome-structure axis with implications in biotechnology and medicine.
[fr] Le réticulum endoplasmique (RE) est formé par un réseau dynamique de tubules et de feuillets en cours de remodelage continu, reflétant ainsi son rôle essentiel dans des fonctions biologiques importantes de la cellule. La morphologie du RE est cruciale pour de nombreuses fonctions cellulaires, notamment la synthèse des protéines, la modification protéique post-traductionnelle, la synthèse des lipides, la régulation de l'homéostasie et de la sécrétion du Ca2+. La glycosylation est l’une des modifications post-traductionnelles ou co-traductionnelles les plus courantes des protéines, affectant la structure, la fonction, la stabilité, le trafic et même la reconnaissance des récepteurs. Dans la plupart des cas, les protéines liées à la membrane ou sécrétées sont glycosylées avec des glycans liés par N ou O. Les protéoglycans (PG), en plus de contenir des N-glycans et des O-glycans canoniques, sont caractérisés par la présence de longues répétitions de sucre attachées via des motifs de glycosylation liés à O. L'exostosine-1 (EXT1) glycosyltransférase est responsable de l'étape d'élongation de la chaîne dans la biosynthèse de l'heparan sulfate (HS) PGs.
La caractérisation des contributions quantitatives et qualitatives des glycans attachés aux protéines des membranes intracellulaires reste peu exploré. Le but de cette thèse est de répondre à cette question en examinant le rôle de EXT1 dans la relation entre la morphologie du RE et ses fonctionnalités.
Dans cette étude, nous avons montré comment la structure, la morphologie et la dynamique du RE sont régulées par EXT1. Nous avons démontré que l'inactivation de EXT1 dans des lignées de cellules de mammifères et des lymphocytes primaires T CD4+ murins entraîne une structure tubulaire du RE étendue, influençant la densité dans le lumen du RE et provoquant une perturbation de la morphologie de Golgi. Ce fait a été révélé par la microscopie électronique et les structures et la modélisation du réseau polygonal RE typique. De plus, la deplétion de EXT1 affecte la voie de la sécrétion, comme le montre l'utilisation de plusieurs rapporteurs in vitro et in vivo. Cette découverte a été corroborée par une analyse protéomique quantitative réalisée dans des cellules HeLa. Une approche métabolomique a indiqué une synthèse de novo et un taux de consommation de nucléotides plus élevés nécessaires à la synthèse d'intermédiaires de sucres tels que UDP-hexoses et UDP-GlcNAc. Nous avons effectué une analyse glycoprotéomique des membranes du RE qui a révélé un glissement vers le complexe N-glycane de taille moléculaire plus élevée lors de l'inactivation de EXT1. Ainsi, EXT1 joue un nouveau rôle fondamental dans la morphogenèse et la dynamique de ER et de Golgi et est nécessaire pour le trafic et la sécrétion de ER à Golgi qui pourraient être couplés à la glycosylation post-traductionnelle des protéines membranaires.
La dépletion de EXT1 entraîne une dimunition globale de la N-glycosylation, probablement suite au controle de la stabilité du complexe oligosaccharyltransférase. Cependant, cette dépletion entraîne la formation des N-glycans de haut poids moleculaires et l'inclusion des O-glycosylation de protéines membranaires, ce qui génère des forces capables d'augmenter l'extension des membranes intracellulaires. Notre étude suggère que les changements de glycosylation représentent une nouvelle dimension fondamentale dans les fonctions du RE et nous recommandons une approche systématique dans l'étude de l'axe structure du RE-protéome-glycome, avec des implications en biotechnologie et en médecine.
