Keywords :
Antigen; Cytokine mRNA expression; T lymphocyte subpopulation; Animals; Cattle; Cell Separation; Cytokines; Flow Cytometry; Polymerase Chain Reaction; RNA, Messenger; T-Lymphocyte Subsets; antigène; lymphocyte T γδ; expression ARNm cytokine
Abstract :
[en] In order to isolate and characterise resting WCl+ γδT cells from cattle, we developed a protocol for purifying these cells by negative selection from peripheral blood. The purification method included five steps: separation of mononuclear cells on lymphoprep, depletion of monocytes by adherence to plasma-coated gelatin enriching T cells on a nylon wool column, depleting CD2+ T cells by sheep red blood cells (SRBC), and finally depleting CD4+ and CD8+ T cells by the magnetic cell sorting technique (MACS). This procedure proved efficient and reproducible, and the purity of the isolated WC1+ γδT cells was more than 97% as analysed by flow cytometry (FACS). Cytokines and costimulatory molecules mRNA expression was assessed by the reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR) technique in freshly isolated resting WC1+ T cells. We found that purified uncultured WC1+ T cells express TNF-α, CD28, CTLA-4 and IL-2Rα mRNA transcripts but do not express those for IL-2, IL-4, IL-6, IL-10 and IFN-γ. The expression of CD28 and CTLA-4 transcripts on bovine WC1+ T cells indicates that these genes are evolutionarily conserved.
[fr] Afin de purifier et de caractériser les cellules T γδ du type WC1+d’origine bovine, nous avons développé un protocole de purification par sélection négative de ces cellules contenues dans le sang périphérique. La méthode de purification comporte cinq étapes, à savoir : la séparation des cellules mononucléés sur lymphoprep, la déplétion des monocytes par adhérence sur de la gélatine couverte de plasma, l’enrichissement des cellules T sur colonne de nylon, la déplétion des cellules T du typeCD2+par formation des rosettes avec les globules rouge du mouton, et enfin la déplétion des cellules TCD4+et CD8+par la technique de « Magnetic cell sorting » (MACS). Le procédé s’est révélé efficace et reproductible, tandis que la pureté des cellules isolées analysées par cytométrie de flux, s’élevait à plus de 97%. Sur les cellules fraîchement isolées, nous avons étudié au moyen de la technique de “reverse transcriptase polymerase chain reaction” (RT-PCR) l’expression de l’ARN messagerdes cytokines et des molécules de costimulation. Nous avons ainsi mis en évidence que les cellules T γδWC1+ fraîchement isolées, non cultivées, expriment les ARNm du TNF-α, du CD28, du CTLA-4et de IL-2Rαtandis que les ARNm de l’IL-2, l’IL-4, l’IL-6, l’IL-10 et de l’IFN-γ n’étaient pas exprimés. L’expression du CD28 et du CTLA-4 sur les cellules T γδWC1+indiquerait que ces gènes ont été conservés durant l’évolution.
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