Reference : Développement et optimisation d'une méthode MALDI-MS/MS pour l'identification de cyan...
Dissertations and theses : Doctoral thesis
Physical, chemical, mathematical & earth Sciences : Chemistry
http://hdl.handle.net/2268/235133
Développement et optimisation d'une méthode MALDI-MS/MS pour l'identification de cyanotoxines
French
[en] Development and optimisation of MALDI-MS/MS method for cyanotoxin identification
Deleuze, Christelle mailto [Université de Liège - ULiège > Département de chimie (sciences) > Laboratoire de spectrométrie de masse (L.S.M.) >]
14-May-2019
Université de Liège, ​Liège, ​​Belgique
Doctorat en Sciences
328
De Pauw, Edwin mailto
Quinton, Loïc mailto
Eppe, Gauthier mailto
Wilmotte, Annick mailto
Flahaut, Christophe mailto
Guillonneau, François mailto
[fr] MALDI ; Cyanotoxines ; Spectrométrie de masse
[en] MALDI ; Cyanotoxin ; Mass spectrometry
[en] Water quality monitoring is an area where miniaturization and speed are key parameters to facilitate portability. In the case of recreational water analysis, ELISA is the most widely used method, and analysis can be performed directly in the field thanks to commercially available kits. This method is robust and sensitive but suffers from a lack of specificity. Indeed, ELISA generally targets only one particular compound or family without distinction between potentially more or less toxic variants.
Cyanobacteria are one of the world's earliest groups of living organisms. If their presence is natural in waterbodies such as lakes or rivers, their abnormally important development under certain conditions is problematic. Indeed, during cell lysis, a very large quantity of toxins can disperse quickly, with potentially dazzling effects such as paralysis followed by the death of the victim in the case of ingestion of saxitoxin, for example.
One of the most widespread cyanotoxines, for which the World Health Organization (WHO) has set a limit of 1 µg/L, is microcystin LR (MC-LR). To date, more than 200 variants of microcystins and other cyanotoxins, of variable toxicity, have been identified. It is therefore essential to include them in recreational water quality monitoring in order to prevent risks as much as possible.
This PhD has been started in that context, with the main goal being to develop new approaches for the analysis and identification of cyanotoxins.
When the identification of the composition of a sample is a must, mass spectrometry (MS) is usually the reference method. In order to improve quantification limits, mass spectrometry is used either at high resolution and/or in "tandem or MS/MS" mode.
The mixtures to be analyzed being complex, to avoid interferences, Pigh-Performance Liquid Chromatography (HPLC) separation was developed upfront mass spectrometry analysis. When a separation technique is coupled with mass spectrometry, it can drive the choice of ion production technology. Electrospray ionization (ESI) was the method of choice. However, another source that grew up in parallel with electrospray ionization, Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation (MALDI) can now be considered in with liquid chromatography separation. The eluent of the HPLC column is dropped onto the consecutive spots of a MALDI analysis plate. This LC MALDI coupling offers interesting performances compared to the HPLC ESI, especially in terms of optimal use of the sample. It is indeed deposited in its entirety on a solid support and is consumed only during LASER shots. The chromatography is somehow stored on the solid support and the analysis can be renewed later.
The final objective of this project is the development of a method for the identification and analysis of cyanotoxins by mass spectrometry coupled to HPLC separation, and more particularly HPLC MALDI MS/MS.
The choice of the MALDI matrix allowing the detection of a maximum of cyanotoxins was made on the basis of an exhaustive review of the literature. The major obstacle of this part of the work was to assess the proposed solutions allowing for the detection of these toxins without interfering in the mass spectrum. The classical MALDI matrices have been evaluated and compared with the alternatives proposed by the scientific community at the beginning of this work (2006). Thus, the 2,5 DHB, HCCA and sinapinic acid matrices, in particular, were tested and compared with alternative matrices such as the DIOS (Desorption/Ionization on Silicon) system, the liquid ion matrices, the porphyrin matrices, titanium dioxide inorganic matrices and graphite carbon from pencil mines, which practical interest is obvious.
In the second part, the reductive properties of the 1,5 DAN matrix were exploited and have allowed the development of a characterization tool for microcystins. This reducing matrix, via the reduction of the C = C double bond of certain microcystins, made possible the classification of microcystins and the discrimination between the amino acids Dhb, Dha and Ser /Ala present in position 7 of the microcystin cycle.
Once the HPLC separation step was developed, we performed the HPLC MALDI coupling via a robotic system in order to start the last part of this work, which is devoted to the analysis of environmental samples and identification of microcystins by HPLC MS/MS by exploiting MALDI and ESI sources, high resolution Orbitrap analyzer and Fourier Transform Ion Cyclotron Resonance Mass Spectrometry (FT ICR-MS).
[fr] Le monitoring des eaux est un domaine où la miniaturisation et la rapidité sont les maîtres mots afin de faciliter la portabilité. Dans le cas de l’analyse d’eaux de baignade, la méthode la plus utilisée est la détection immunologique ELISA, rendue possible sur le terrain via des kits commercialement accessibles. Cette méthode, robuste et sensible, souffre d’un défaut de spécificité en ne ciblant, en général, qu’une famille de composés sans permettre de distinction entre les dizaines de variants potentiellement plus ou moins toxiques.
Les cyanobactéries sont l’un des premiers groupes d’organismes vivants recensés aux origines du monde. Si leur présence est naturelle dans les étendues d’eau telles les lacs ou rivières, leur développement anormalement important dans certaines conditions est problématique. En effet, lors de la lyse cellulaire, une quantité très importante de toxines peut se disperser rapidement, avec des effets potentiellement fulgurants – comme la paralysie suivie du décès de la victime dans le cas d’une ingestion de saxitoxine par exemple.
L’une des cyanotoxines la plus répandue et pour laquelle l’Organisation Mondiale de la Santé (OMS) a fixé une limite de 1µg/L est la microcystine LR (MC-LR). A ce jour, plus de 200 variants de microcystines et d’autres cyanotoxines, de toxicité variable, ont été recensés. Il est donc primordial de les inclure dans le monitoring des eaux de baignade afin de prévenir au maximum les risques.
C’est dans ce contexte que se situe ce travail de thèse, dont l’objectif est de mettre au point de nouvelles approches pour l’identification et l’analyse de cyanotoxines.
Lorsque l’identification des constituants d’un échantillon est souhaitée voire, requise, la spectrométrie de masse (MS) est généralement la méthode de référence. Afin d'améliorer les limites de quantification, la spectrométrie de masse est utilisée soit à haute résolution et/ou en mode "tandem ou MS/MS".
Les mélanges à analyser étant complexes, afin d’éviter les nombreuses interférences potentielles, une séparation par chromatographie liquide à haute performance (HPLC) a été mise au point en amont de la spectrométrie de masse. Le couplage d’une technique de séparation avec la spectrométrie de masse, peut imposer la technique de production d’ions dont les caractéristiques sont essentielles pour le succès de la méthode globale. L’ionisation par électrospray (ESI) était la technique de choix. Toutefois, parallèlement au développement des méthodes d’ionisation à pression atmosphérique, une autre source a également soulevé l’intérêt : la désorption ionisation laser assistée par matrice (Matrix Assisted Laser Desorption/Ionisation : MALDI). Cette méthode d'ionisation peut désormais être envisagée en couplage avec la chromatographie liquide. L'éluant de la colonne HPLC est déposé goutte à goutte sur les plots consécutifs d’une plaque d'analyse MALDI. Ce couplage LC MALDI offre des performances intéressantes par rapport à l’HPLC ESI, notamment sur le plan de l’utilisation optimale de l’échantillon. Celui ci est en effet déposé dans sa totalité sur un support solide et n'est consommé que lors des tirs LASER. La chromatographie est en quelque sorte stockée sur le support solide et l’analyse peut être renouvelée ultérieurement.
L'objectif final de ce projet est le développement d’une méthode d’identification et d’analyse de cyanotoxines par spectrométrie de masse couplée à une séparation HPLC, et plus particulièrement le couplage HPLC MALDI MS/MS.
Le choix de la matrice MALDI permettant la détection d’un maximum de cyanotoxines a été effectué sur base d’une revue exhaustive de la littérature. L’obstacle de taille de cette partie du travail était d’évaluer les solutions proposées qui permettent la détection de ces toxines sans interférer dans le spectre de masse. Les matrices MALDI classiques ont été évaluées et comparées avec les alternatives proposées par la communauté scientifique à l’entame de ce travail (2006). Ainsi, les matrices 2,5 DHB, HCCA et l’acide sinapinique, notamment, ont été testées et comparées aux matrices alternatives telles que le système DIOS (Desorption/Ionisation on Silicon), les matrices ioniques liquides, les matrices porphyrines, les matrices inorganiques de type dioxyde de titane et le carbone graphite issu de mines de crayon, dont l’intérêt pratique est évident.
Dans une seconde partie, les propriétés réductrices de la matrice 1,5 DAN ont été exploitées et ont permis la mise au point d’un outil de caractérisation des microcystines. Cette matrice réductrice, via la réduction de la double liaison C=C de certaines microcystines, a rendu possible la classification des microcystines et la discrimination entre les acides aminés Dhb, Dha et Ser/Ala présents en position 7 du cycle des microcystines.
Une fois l’étape de séparation HPLC mise au point, nous avons réalisé le couplage HPLC MALDI via un système robotisé afin d’entamer la dernière partie de ce travail, laquelle est consacrée à l’analyse d’échantillons environnementaux et l’identification de microcystines par HPLC MS/MS en exploitant les sources MALDI et ESI, et les analyseurs à haute résolution que sont l’Orbitrap et la spectrométrie de masse à résonance cyclotronique ionique et transformée de Fourier (FT ICR MS).
Fonds pour la formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture (Communauté française de Belgique) - FRIA
Researchers ; Students
http://hdl.handle.net/2268/235133

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