Etude de protéines du divisome chez E. coli : caractérisation du sous-complexe FtsW-PBP3-PBP1b et du domaine AMIN de l'amidase AmiC

De nos jours beaucoup d’antibiotiques sont connus mais leur surconsommation conduit à l’émergence de souches bactériennes capables de résister à leur action, il est donc nécessaire de trouver de nouvelles cibles. Durant la division cellulaire bactérienne, la formation d’un septum de peptidoglycane (PG) par les synthases et le clivage de ce dernier par les amidases pour séparer les deux cellules filles sont deux étapes importantes, sous le contrôle d’un complexe multiprotéique appelé le divisome. Dans ce travail, nous avons étudié les interactions entre les protéines directement impliquées dans la synthèse du septum et l’effet de ces interactions sur celle-ci. Nous avons aussi essayé de déterminer le mécanisme d’interaction entre le PG et le domaine AMIN de l’amidase AmiC, ces processus étant des cibles potentielles pour le développement de nouveaux agents antibactériens.
Chez E. coli, les enzymes directement responsables de la synthèse du PG septal sont la PBP3 et la PBP1b. Cette synthèse serait coordonnée avec l’activité encore mal définie (flippase et/ou transglycosylase) de FtsW et régulée par FtsN ainsi que d’autres protéines. FtsN joue également un rôle dans le maintien et la stabilité du divisome. Néanmoins, les mécanismes moléculaires exacts des fonctions de ces quatre protéines au sein du divisome sont mal connus. Dans ce travail, nous démontrons que FtsW interagit avec PBP1b et le lipide II mais aussi que PBP1b, FtsW et PBP3 forment un complexe ternaire. Nous démontrons également que la grande boucle entre les TM 7/8 de FtsW est importante pour l'interaction avec PBP3. De plus, nous avons mis en évidence une inhibition par FtsW de la polymérisation du lipide II en PG par PBP1b et que PBP3 lève cet effet inhibiteur. Ces résultats suggèrent que FtsW interagit avec le lipide II empêchant sa polymérisation par PBP1b et que PBP3 en interagissant avec FtsW facilite la libération du lipide II et/ou son transfert à PBP1b. Ce mécanisme de régulation étroit est compatible avec le besoin de la cellule d'assurer une utilisation appropriée du stock limité de lipide II.
Le septum une fois formé divise la cellule et doit être clivé pour permettre la séparation des cellules filles et la maturation des nouveaux pôles cellulaires. Les amidases dont AmiC sont responsables de la scission et la répartition du septum entre les deux nouveaux pôles des cellules filles. Ces enzymes sont activées de manière spécifique par des protéines caractérisées par la présence d'un domaine LytM également recrutées au site de division, ainsi AmiC est activé par NlpD. AmiC est composée d’un domaine catalytique et d’un domaine AMIN qui lie le peptidoglycane et est nécessaire et suffisant pour la localisation de la protéine au site de division. Néanmoins, le mode d’interaction du domaine AMIN avec le PG pour la localisation au site de division et le mécanisme exact d’activation de l’amidase sont encore mal compris. Nous avons établi par RMN que 13 résidus du domaine AMIN seraient importants pour l’interaction avec le PG et que la nature du celui-ci jouait aussi un rôle dans cette interaction. Parallèlement, nous avons élaboré une banque de 41 mutants du domaine AMIN pour caractériser leurs impacts sur l’interaction des protéines mutées avec le peptidoglycane et/ou leur localisation au site de division. Parmi ces protéines mutées, 27 ont été purifiées et 11 ont été testées en co-précipitation avec le peptidoglycane avec lequel elles ont toutes interagit. Des constructions permettant l’analyse de la localisation de ces protéines mutées in vivo en fusion avec la sfGFP ont aussi été réalisées. Enfin, le domaine LytM de NlpD a été cristallisé.