Doctoral thesis (Dissertations and theses)
Génération d’une librairie de mutants de Bacillus licheniformis 749/I par l’insertion aléatoire d’un transposon pour identifier les gènes impliqués dans l’induction de la β-lactamase BlaP
Lebrun, Sarah
2017
 

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Keywords :
b-lactamase; induction; Bacillus
Abstract :
[fr] La production de la b-lactamase BlaP chez Bacillus licheniformis 749/I est induite par la présence d’un antibiotique à noyau b-lactame (b-lactamine) dans le milieu extérieur. Le récepteur membranaire BlaR1 détecte la présence de la b-lactamine et transmet un signal vers le cytoplasme. La protéine BlaR1 est composée de deux domaines : le domaine C-terminal (BlaR-CTD) exposé à l’extérieur de la cellule qui détecte la présence de l’antibiotique et le domaine N-terminal membranaire (BlaR-NTD) agissant comme un transducteur et un amplificateur du signal perçu par le domaine senseur. En présence de b-lactamine, l’acylation de BlaR-CTD par l’antibiotique entraîne un changement conformationnel des segments transmembranaires menant à l’activation de la boucle L3 de BlaR-NTD. Le répresseur BlaI, qui réprime la transcription du gène blaP, est inactivé par liaison d’un coactivateur, le dipeptide D-Glu--mA2pm issu de la dégradation du peptidoglycane à l’extérieur de la cellule. La voie d’entrée de ce dipeptide n’est pas connue ainsi que le locus blaR2 impliqué dans l’induction de la b-lactamase. L’objectif principal de ce travail est l’identification du locus blaR2 par la construction d’une banque aléatoire de mutants par transposition. La première étape du travail était la mise au point de la transformation de Bacillus licheniformis 749/I par un plasmide possédant une origine thermosensible et porteur d’un transposon modifié. Un clone recombinant a été obtenu par la méthode de transformation de protoplastes avec de l’ADN sous forme concatémère. Une banque d’environ 11.300 clones a été générée et validée. Une méthode de criblage sur boite via un test iodométrique a mis en évidence cinq mutants sur l’entièreté de la banque présentant une différence d’induction par rapport à la souche sauvage. L’identification des insertions chromosomique du transposon a été réalisée par PCR inverse et par AP-PCR et a permis d’identifier trois clones insérés dans le gène blaR1 et deux dans le gène blaP. Ces mutants sont tous différents entre eux. Une seconde stratégie a été envisagée en vue d’identifier le locus blaR2 par complémentation du mutant chimique blaR2- par l’ADN génomique isssus des mutants de la souche sauvage générés à partir du transposon. La souche blaR2- a été transformée cependant, aucun événement de recombinaison n’a pu être observé. Sur base de ces expériences, la question de l’identification du locus blaR2 reste en suspens. Néanmoins, au cours de l’isolement des clones contenant le transposon, nous avons mis en évidence des clones présentant des colonies possédant un phénotype « luisant » par rapport à l’aspect mat de la souche sauvage. Un gène codant pour une estérase (Bl-EstA) a été ainsi identifié et le produit du gène étudié. Bl-EstA appartient à la famille des lipases « hormone-sensitive lipase like_1 » (Famille IV de la classification d’Arpigny et Jaeger (1999)) et possède toutes les caractéristiques des a/b hydrolases. Bl-EstA est sous la forme dimérique en solution et peut adopter différents comportements cinétiques en fonction des substrats qu’elle hydrolyse : une cinétique Michaélienne classique, allostérique ainsi qu’une inhibition par le substrat. Ces comportements impliquent, au moins, la présence d’un site régulateur. Enfin, l’inactivation de Bl-EstA par les alcools n’est pas favorable à son utilisation pour des réactions de transestérifications et dès lors pour des applications industrielles.
Research center :
CIP - Centre d'Ingénierie des Protéines - ULiège
Disciplines :
Biochemistry, biophysics & molecular biology
Author, co-author :
Lebrun, Sarah ;  Université de Liège > Département de sciences des denrées alimentaires (DDA) > Département de sciences des denrées alimentaires (DDA)
Language :
French
Title :
Génération d’une librairie de mutants de Bacillus licheniformis 749/I par l’insertion aléatoire d’un transposon pour identifier les gènes impliqués dans l’induction de la β-lactamase BlaP
Defense date :
30 March 2017
Number of pages :
232
Institution :
ULiège - Université de Liège
Degree :
Docteur en Sciences
Promotor :
Joris, Bernard ;  Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie
President :
Charlier, Paulette ;  Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie > Macromolécules biologiques
Secretary :
Feller, Georges ;  Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS)
Jury member :
Delmarcelle, Michaël ;  Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS)
Ongena, Marc ;  Université de Liège - ULiège > Département GxABT > Microbial, food and biobased technologies
De Bolle, Xavier
Leclère, Valérie
Funders :
FRIA - Fonds pour la Formation à la Recherche dans l'Industrie et dans l'Agriculture [BE]
Available on ORBi :
since 07 April 2017

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