Abstract :
[fr] Dans ce travail, nous avons montré que la protéine RSZ22, est une protéine hautement dynamique. Cette protéine fait partie de la sous-famille des protéines RSZ d’Arabidopsis et est l’homologue de la protéine SRSF7 humaine. Elle possède un domaine RRM, un domaine RS et entre les deux un domaine de liaison au RNA Zn-knuckle de type CCHC. L’utilisation des approches de FRAP (Fluorescence Recovery After Photobleaching) et de FLIP (Fluorescence Loss In Photobleaching) ont permis d’étudier la dynamique de cette protéine mais aussi sa capacité de navette entre le noyau et le cytoplasme comme son homologue humain SRSF7. Ces études ont été réalisées avec RSZ22 fusionnée à la GFP et surexprimée transitoirement dans des cellules foliaires mais aussi en transformation stable chez Arabidopsis (Rausin et al., 2010; Tillemans et al., 2006). Dans cette étude, nous avons montré que RSZ22, comme les protéines de la famille SR, est une protéine navette. Par analyses de FLIP-shuttling nous avons pu établir des cinétiques d'exportation et confirmer que les protéines SR végétales utilisent le récepteur CRM1/XPO1 comme voie d’exportation. Sa mobilité dépend du niveau de phosphorylation et de la concentration en ATP de la cellule. La complémentarité des techniques de surexpression en transformation transitoire et de l’expression stable ayant été démontrée (Rausin et al., 2010), nous nous y sommes référés pour notre étude de dynamique des protéines nucléaires.
Nous avons également cherché à évaluer les rôles des domaines d’accrochage au RNA de RSZ22 dans sa localisation et sa dynamique. Par mutagenèse dirigée, nous avons modifié les acides aminés conservés connus pour jouer un rôle dans les interactions avec le RNA (Clery et al., 2008; Hargous et al., 2006; Lunde et al., 2007; Maris et al., 2005; Phelan et al., 2012). Nos résultats montrent que les domaines Zn-knuckle et RRM fonctionnels ne sont pas nécessaires à la localisation nucléaire de la protéine RSZ22, ni à sa localisation en speckles. La dynamique nucléocytoplasmique de la protéine RSZ22 n’est pas altérée par la mutation des motifs Zn-knuckle et RNP1. Cependant, les protéines mutées de RSZ22 répondent différemment aux traitements par la LMB. En effet, celles-ci ne sont plus « retenues » dans le noyau après un tel traitement et continuent d’être exportées vers le cytoplasme. Sachant que la LMB est un inhibiteur spécifique de la voie CRM1/XPO1, ce dernier récepteur est impliqué dans l’exportation des protéines SR en interaction avec le RNA (Williams et al., 2008).
Dans la suite des recherches réalisées au sein du laboratoire, nous avons étudié la dynamique nucléo-cytoplasmique des protéines SR, en étudiant la sous-famille SRSF1-like. Chez Arabidopsis thaliana, cette famille se compose des protéines SR34, SR34a, SR34b et SR30 et possède deux domaines RRM et un domaine RS. Comme RSZ22, SR34 et SR34a font la navette entre le noyau et le cytoplasme. Nous formulons ainsi l’hypothèse que comme son homologue humain SRSF1, SR34 pourrait être impliquée dans l’exportation du mRNA vers le cytoplasme. Nous avons analysé les rôles des différents domaines de SR34 par mutagénèse dirigée. Nous avons montré que le domaine RS de la protéine SR34 est nécessaire pour la localisation nucléaire et la stabilité de la protéine. Les motifs de liaison au RNA sont impliqués dans l’exportation de SR34 par la voie CRM1/XPO1.
Par la technique du double hybride en levure, une interaction entre SR34 et SR45 a pu être mise en évidence et confirmée par FLIM-FRET (Fluorescence-Lifetime Imaging Microscopy - Fluorescence Resonance Energy Transfert). L’analyse des interactions entre SR45 et les protéines SR34 mutantes montre l’importance des différents domaines de la protéine dans les interactions protéine-protéine.
