Contribution à l’étude de la cryopréservation des cellules souches embryonnaires humaines à visée thérapeutique

Les cellules souches embryonnaires humaines (hES) sont caractérisées par une capacité d’autorenouvellement quasi-illimitée et une aptitude à se différencier en tous les types cellulaires caractéristiques des trois feuillets embryonnaires primitifs. Elles sont considérées avec celles qui y sont étroitement apparentées, les cellules souches pluripotentes induites (iPS), comme une source virtuellement inépuisable de cellules pour la recherche biomédicale et les thérapies cellulaires. Cependant, leur utilisation clinique requiert efficacité optimale et sécurité biologique sans faille des procédés, matériels et réactifs utilisés. La cryopréservation est une étape clé indispensable pour le stockage et le transport de ces cellules, au cours de laquelle elles sont soumises à des conditions physiques et chimiques extrêmes, susceptibles d’altérer leur viabilité et leurs propriétés biologiques. Les méthodes efficaces de cryopréservation visent à garantir le maintien de ces propriétés tout en assurant le taux maximum de survie. De plus, un protocole optimal devrait permettre de préserver une grande quantité de cellules en une fois. Enfin, le respect des bonnes pratiques de fabrication (GMP) et la conformité aux directives européennes relatives à la manipulation et au stockage des cellules pour un usage thérapeutique requièrent la stérilité des échantillons, la reproductibilité, la traçabilité, la standardisation et l’automatisation du processus.

Les cellules hES sont habituellement cryopréservées par congélation lente conventionnelle, dont les résultats peu satisfaisants en termes de survie cellulaire résultent essentiellement des dommages cellulaires liés à la cristallisation. Afin de réduire ces dommages, la vitrification a été développée comme méthode alternative pour la cryopréservation des embryons murins, bovins et, depuis peu, humains. Elle consiste en la transformation, sans cristallisation, d’un liquide en un solide amorphe par une augmentation brutale et infinie de sa viscosité. Pour que les liquides cellulaires atteignent cet état solide amorphe, la vitrification nécessite l’utilisation de concentrations élevées en cryoprotecteurs combinée à des vitesses de refroidissement et de réchauffement très élevées. Plusieurs groupes ont adapté les protocoles de vitrification aux cellules hES et ont montré que la vitrification est plus efficace que la congélation lente en termes de survie cellulaire et de maintien des cellules à l’état indifférencié. Cependant, la majorité des protocoles de congélation lente et de vitrification ne peuvent assurer la sécurité biologique de l’échantillon car les cellules sont stockées dans des conteneurs susceptibles de laisser pénétrer de l’azote liquide. De plus, à ce jour, aucun protocole de vitrification des cellules hES ne répond à l’ensemble des critères précédemment cités.

La première étude présente notre nouvelle méthode de cryopréservation des cellules hES basée sur une vitrification aseptique dans des pailles scellées. En effet, le maintien de la stérilité et de l’absence de substances toxiques indésirables implique que tout contact direct des cellules avec l’azote liquide doit être évité. De plus, la méthode consiste en des additions successives de milieux avant refroidissement et après réchauffement, sans manipulation directe des cellules, ce qui la rend plus aisée à mettre en œuvre et compatible avec une automatisation. Les différents milieux utilisés sont chimiquement définis et biologiquement sûrs. Afin d’en estimer l’efficacité, nous l’avons comparée à la congélation lente conventionnelle. Nous avons montré que notre méthode de vitrification aseptique des cellules hES est aussi efficace que la congélation lente conventionnelle en termes de survie et est supérieure concernant le maintien de l’état indifférencié. Elle permet en outre de conserver leurs propriétés biologiques et cytogénétiques après réchauffement et expansion.

La plupart des auteurs sont favorables à la vitrification pour la cryopréservation des embryons et cellules en termes de survie post-réchauffement. Cependant, les solutions auxquelles sont exposées les cellules au cours de la vitrification ont une concentration en cryoprotecteurs 3 à 4 fois supérieure à celles des solutions utilisées au cours de la congélation lente (4,8-6,4M versus 1,5M). Dans ce cadre, la seconde étude consiste à estimer la concentration intracellulaire en cryoprotecteurs (ICCP) lors de la vitrification et de la congélation lente. Pour ce faire, nous avons utilisé le zygote murin comme modèle cellulaire. Nous avons montré que l’ICCP lors de la vitrification est quasiment égale à 2,14M juste avant de plonger les cellules dans l’azote liquide, et équivaut donc au tiers de la concentration dans la solution vitrifiante (6,4M). De plus, nous avons montré que l’ICCP est plus basse après vitrification qu'après congélation lente. Nos résultats contribuent à expliquer pourquoi la vitrification est paradoxalement plus efficace que la congélation lente pour la cryopréservation des embryons et des cellules souches malgré l’utilisation de concentrations très élevées - potentiellement toxiques - en cryoprotecteurs dans les milieux.

A notre connaissance, notre méthode de vitrification aseptique est la première méthode qui combine les diverses propriétés prédéfinies. Notre technique de cryopréservation est donc très prometteuse pour le stockage et le transport des cellules hES ou des cellules équivalentes, y compris dans le cadre d’applications cliniques qui exigent de hauts standards d’efficacité et de sécurité.