Abstract :
[en] A screening of lactic acid bacteria (LAB) with bacteriocin-like inhibitory activity against Listeria monocytogenes was performed. The screening was conducted in 27 traditional artisanal-produced cheeses obtained from different Peruvian regions. Two thousand two hundred and seventy seven strains (2277) were isolated, of which 20 exhibited bacteriocin-like inhibitory activity, two strains stand out for having higher activity against listeria, as well as stability at pH value of 2-11 and a thermal stability.
The two strains were identified using 16 S ribosomal DNA method, and were registered in the GenBank database of NCBI (National Center for Biotechnology Information). These were Enterococcus faecium CWBI-B1430 (accession number EF591817) and Enterococcus mundtii CWBI-B1431 (accession number EF591816). Two of the major factors concerned in a potential health risk associated with the genus Enterococcus were evaluated, and it was demonstrated that they were sensitive to vancomycin and showed no hemolytic activity.
Genetic studies showed the presence of four putative bacteriocin genes in both strains, these were enterocin A, enterocin B, enterocin P, and mundticin KS. The reverse transcription-PCR analysis was realized, the expression of the bacteriocin genes enterocin A, enterocin B, and mundticin KS in CWBI-B1430 was showed, while bacteriocin genes enterocin P and mundticin KS was demonstrated in CWBI-B1431. These results are the first report of the expression of mundticin KS in E. faecium and enterocin P in E. mundtii. Also, the expression was studied at different temperatures, unlike the enterocin P, where only a positive signal was obtained at 12 and 37°C. All other enterocin showed positive signal at 12, 30, 37 and 42°C.
The production of bacteriocins on a small scale, in both strains was studied. It was investigate the influence of initial pH (4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 and 7.0), temperature (25, 30 and 37°C) and oxygen level (anaerobic, microaerobic and aerobic). The conditions for maximizing the production of bacteriocins are : initial pH of 7.0, at 37 °C, and microaerobic conditions for CWBI-B1430 strain; initial pH of 6.5, at 37 °C, and an aerobic condition for CWBI-B1431. The influence of the source of carbon and nitrogen, as well as their concentration in the bacteriocin production, was studied. The study of the production of short-chain fatty acids by these strains of multiproducing bacteriocins, showed the propionic acid as the most important.
The purification study confirmed that the two bacteria in question are multi-producing of bacteriocins, as shown by the obtained chromatograms, showing different molecular weights, different charge and hydrophobicity level.
The results of in situ application of the two selected strains or their supernatant does not show the same efficiency as those obtained in vitro. Factors such as temperature and food composition may be the origin of these results.
Therefore, we propose the use of both strains in the food industry, for being multi-producing bacteriocins, have broad spectrum of inhibition and because the substances that produce have functional properties that are useful in the food industry.
[fr] Une sélection des bactéries lactiques contenant une activité antimicrobienne contre Listeria monocytogenes a été réalisée dans 27 échantillons de fromages frais artisanaux d’origine péruvienne. Deux mille deux cent soixante dix-sept (2277) souches ont été isolées. Vingt d’entre elles ont été sélectionnées pour leur capacité inhibitrice de type bactériocine et deux se distinguent par leur capacité anti-Listeria ainsi que pour leur stabilité dans une gamme de pH 2-11 et leur stabilité thermique.
Ces deux souches ont été identifiées en utilisant le séquençage de l’ADN ribosomiaux 16S et elles ont été enregistrées dans la base de données GenBank, comme, Enterococcus faecium CWBI-B1430 (numéro de référence EF591817) et Enterococcus mundtii CWBI-B1431 (numéro de référence EF591816). L’évaluation de l’innocuité a montré que les deux souches sont sensibles à la vancomycine et ne présentent pas d’activité hémolytique.
La recherche de gènes structuraux à l’aide d’une méthode PCR a mis en évidence la présence de quatre entérocines pour chacune de ces deux souches, entA, entB, entP et munKS. L’expression de ces gènes, déterminée par la technique de RT-PCR (Reverse Transcription PCR), a montré l’expression d’entA, entB et munKS chez CWBI-B1430 et entP et munKS chez CWBI-B1431. C’est la première fois que l’expression d’entP chez E. mundtii et munKS chez E. faecium a été montrée. Par ailleurs, nous avons continué l’étude sur l’expression des gènes à différentes températures de culture (12, 30, 37 et 42°C). Un signal positif a été obtenu pour entA, entB, et munKS, alors que entP n’a été exprimé qu’à 12 et 37°C.
Par la suite, nous avons étudié la production des bactériocines en fioles par les deux souches sélectionnées. Dans un premier temps, l’influence du pH (4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 et 7.0), de la température (35, 30 et 37°C) et le niveau d’aération (aérobie, microaérobie et anaérobie) ont été étudiés. Les productions maximales des bactériocines ont été trouvées dans les conditions suivantes : à pH 7,0, 37°C et microaérobie pour CWBI-B1430; à pH 6,5, 37°C et aérobie pour CWBI-B1431. L’influence de la source de carbone et d’azote, ainsi que la concentration de ces deux sources sur la production des bactériocines ont été étudiées. Les meilleurs résultats pour les deux souches ont été obtenus à une concentration de 5% de lactose et de 4% d’extrait de viande. Parmi les métabolites issus de la fermentation de ces souches multi-productrices d’entérocines, on distingue notamment l’acide propionique.
L'étude de purification confirme que les deux bactéries sont multi-productrices de bactériocines, comme le montrent les chromatogrammes obtenus, présentant différents poids moléculaires, charge et niveau de hydrophobicité différents.
Les résultats d'application in situ des deux souches sélectionnées ou de leur surnageant n'ont pas montré la même efficacité que ceux obtenus in vitro. Des facteurs tels que la température et la composition des aliments peuvent être à l'origine de ces résultats.
Ces résultats préconisent l’emploi combiné de ces deux bactéries dans l’industrie des aliments, ce qui élargit le spectre d’inhibition grâce aux multiples bactériocines produites et augmente l’importance des propriétés fonctionnelles.
[es] Se realizó la búsqueda de bacterias lácticas con actividad inhibitoria contra Listeria monocytogenes. El escrutinio fue realizado en 27 quesos frescos artesanales de origen peruano. Dos mil dos cientos setenta y siete (2277) bacterias fueron aisladas, de las cuales, 20 fueron seleccionadas por presentar capacidad inhibitoria de tipo bacteriocina, de éstas, dos destacaron por su capacidad contra listeria, así como por su estabilidad a un rango de pH de 2-11 y por su estabilidad térmica.
Las dos cepas fueron identificadas utilizando la técnica del ADN ribosómico 16S y registradas en GenBank, estas fueron Enterococcus faecium CWBI-B1430 (accesión N° EF591817) y Enterococcus mundtii CWBI-B1431 (accesión N° EF591816). El estudio de dos de los principales factores de riesgo del género Enterococcus, demostró que estas dos cepas no presentan riesgo para la salud; porque son sensibles a la vancomicina y no presentan actividad hemolítica.
El estudio genético para la identificación de las bacteriocinas demostró la presencia de genes estructurales de cuatro enterocinas en ambas cepas, estos fueron entA, entB, ent P y munKS. A continuación la expresión de los genes presentes fue evaluada, la expresión de entA, entB y munKS fue obtenida en CWBI-B1430; mientras que, ent P y munKS fueron obtenidos en CWBI-B1431. Estos resultados muestran por primera vez la expresión de munKS en E. faecium y entP en E. mundtii. Así mismo, se estudio la expresión a diferentes temperaturas; a diferencia de la enterocina P, donde sólo se obtuvo señal positiva a 12 y 37°C, todas las otras enterocinas mostraron señal positiva a 12, 30, 37 y 42°C.
A continuación se estudió la producción de las bacteriocinas a pequeña escala, en ambas cepas. Primero se estudió la influencia del pH (4.5, 5.0, 5.5, 6.0, 6.5 y 7.0), de la temperatura (25, 30 y 37°C) y el nivel de aireación (aerobiosis, microaerobiosis y anaerobiosis). Las condiciones de maximización de la producción de bacteriocinas son : pH 7.0, 37°C y microaerobiosis para la cepa CWBI-B1430; pH 6.5, 37°C y aerobiosis para CWBI-B1431. La influencia de la fuente de carbono y de nitrógeno, así como de su concentración, en la producción de la bacteriocina fue estudiada. Entre los metabolitos de estas cepas multiproductoras de bacteriocinas se distingue el ácido propiónico.
El estudio de la purificación confirmó que las dos bacterias en estudio son multiproductoras de bacteriocinas, como lo muestran los cromatogramas obtenidos, presentando diferente peso molecular, diferente carga y nivel de hidrofóbicidad.
Los resultados de la aplicación in situ de las dos cepas seleccionadas o de sus sobrenadantes, no muestra la misma eficacia que aquellos obtenidos in vitro. Factores como la temperatura y la composición del alimento pueden ser el origen de estos resultados
Por lo tanto, se propone el uso de ambas cepas en la industria de alimentos, por ser múltiples productores de bacteriocinas, por lo tanto presentan mayor espectro de inhibición y porque las sustancias que producen tienen propiedades funcionales útiles en la industria de alimentos.
