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Abstract :
[fr] Les férredoxines (FDX) sont de petites protéines fer-soufre qui fournissent des électrons à diverses voies métaboliques. La microalgue verte Chlamydomonas reinhardtii est assez unique en ce qu’elle possède douze FDX. L’isoforme chloroplastique majeure, FDX1 ou PETF, assure le transfert d’électrons entre le photosystème I et le NADPH via la férredoxine–NADP⁺ réductase. FDX1 joue également un rôle central en conditions anoxiques, où elle couple l’activité de la pyruvate-férredoxine oxydoréductase et des hydrogénases [Fe-Fe]. Dans le cadre d’une approche de biologie synthétique, nous avons cherché à relocaliser FDX1 dans les mitochondries et à évaluer les conséquences métaboliques de cette relocalisation. Six unités transcriptionnelles ont été construites par clonage modulaire. La séquence génomique endogène de FDX1, dans laquelle la région codant le peptide de ciblage chloroplastique prédit a été remplacée par une séquence de ciblage vers la matrice mitochondriale, a été combinée avec différents promoteurs et terminateurs. Les unités transcriptionnelles obtenues contenaient en outre la séquence permettant une fusion C-terminale avec la nanoluciférase. Les constructions ont été exprimées dans deux souches : une souche témoin et une souche mutante dans laquelle le gène codant une histone désacétylase de type Sir2 est inactivé, cette mutation augmentant l’expression de gènes exogènes. Le niveau d’expression de FDX1 a été évalué par mesure de l’activité nanoluciférase. Pour chaque construction et chaque souche, des transformants présentant une activité nanoluciférase faible, intermédiaire ou élevée ont été sélectionnés pour des analyses ultérieures. La présence de la protéine marquée dans les mitochondries est actuellement analysée par immunoblot à l’aide d’anticorps dirigés contre la nanoluciférase et FDX1 à partir de fractions mitochondriales enrichies. La comparaison de ces résultats pour chaque unité d’expression et chaque souche permettra d’identifier la combinaison optimale pour l’expression mitochondriale de FDX1. L’étape suivante consistera à vérifier que la FDX1 relocalisée est fonctionnelle dans les mitochondries. Une caractérisation plus approfondie des transformants sera ensuite réalisée afin d’étudier les effets sur le métabolisme rédox mitochondrial.
