Abstract :
[en] Osteoblast differentiation has been studied using a variety of systems, ranging from osteosarcoma cell lines to differentiating mesenchymal stem cells to KO mice, resulting in the description of a set of transcription factors and regulatory pathways that are involved in this process. Small teleost model systems like zebrafish are increasingly used to study vertebrate skeletal development and zebrafish mutants and transgenic lines are very useful models for studying human pathologies such as osteoporosis, osteopetrosis and osteoarthritis.
Understanding osteoblast differentiation and their function in bone matrix deposition and mineralization is central to the comprehension of bone development and of various bone pathologies. It is, therefore, crucial to not only follow the expression of some landmark transcription factors or extracellular matrix (ECM) proteins, but to also investigate the status of signalling pathways and factors regulating these processes. This can only be achieved by assessing the entire transcriptome of these cells. Zebrafish larvae offer the unique opportunity to directly access osteoblasts from the entire body without specific dissection. The aims are to study the osteoblast transcriptome of developing zebrafish and to investigate the role of the efemp1, fbln1, and col10a1a genes, coding for ECM proteins, in zebrafish skeletal development.
To gain insights into the mechanisms of osteoblast differentiation in the early development stage, we isolated cells from the transgenic reporter line Tg(sp7:sp7-GFP) at 4 days post-fertilization. Based on their differential GFP fluorescence, we identified two subpopulations of which we conducted transcriptomic profiling. Our data revealed that these two subpopulations are clearly distinct and that they differentially express many genes involved in skeletal development. The expression profile of these two populations clearly identifies them as osteoblastic cells, at present we consider the low fluorescence P1 population as pre-osteoblastic cells and the highly fluorescent P2 population as intermediate, functional osteoblasts.
ECM proteins are of crucial importance for cartilage and bone tissues. Based on their differential expression profile in these subpopulations, we generated mutants of the ECM protein coding genes col10a1a, fbln1 and efemp1 to examine their functions. Our results show that mutation of col10a1a results in decreased mineralization, while mutation of fbln1 results in increased mineralization and a missing operculum. Mutation of efemp1 results in increased mineralization and reduced intervertebral space, providing a model for spinal osteoarthritis. Furthermore, we investigated the effects of two probiotics on bone matrix synthesis and mineralization. We discovered that probiotic treatment is able to promote bone formation and to prevent the effects of inhibiting BMP signalling, with Bacillus subtilis being the more potent.
Collectively, these insights provide valuable cues that may contribute to improve understanding the roles of ECM proteins and probiotics in development, growth, and health of the bone skeleton.
[fr] La différenciation des ostéoblastes a été étudiée à l'aide de divers modèles, allant des lignées cellulaires d'ostéosarcomes aux cellules souches mésenchymateuses jusqu'aux souris KO, aboutissant à la description d'un ensemble de facteurs de transcription et de voies de régulation impliqués dans ce processus. Des modèles de petits téléostéens, comme le poisson zèbre, sont de plus en plus utilisés pour étudier le développement du squelette des vertébrés, les mutants du poisson zèbre et les lignées transgéniques ce sont avérés très utiles pour étudier les pathologies humaines telles que l'ostéoporose, l'ostéopétrose ou l'arthrose.
Comprendre la différenciation des ostéoblastes et leur fonction dans le dépôt et la minéralisation de la matrice osseuse est essentiel à la compréhension du développement osseux et de diverses pathologies osseuses. Il est donc crucial non seulement de suivre l’expression de certains facteurs de transcription ou de protéines de la matrice extracellulaire (ECM), mais également d’étudier l’état des voies de signalisation et des facteurs régulant ces processus. Ceci ne peut être réalisé qu'en évaluant l'ensemble du transcriptome de ces cellules. Les larves de poisson zèbre offrent l'opportunité unique d'accéder directement aux ostéoblastes du corps entier sans dissection spécifique, car elles ne se différencient pas au sein de la moelle osseuse. Les objectifs sont d'étudier le transcriptome des ostéoblastes du poisson zèbre en développement et d'étudier le rôle des gènes efemp1, fbln1 et col10a1a, codant pour des protéines de l’ECM, dans le développement du squelette du poisson zèbre.
Pour mieux comprendre les mécanismes de différenciation des ostéoblastes au début du développement, nous avons isolé des cellules de la lignée rapporteuse transgénique Tg(sp7:sp7-GFP) à 4 jours après la fécondation. Sur base de leur fluorescence GFP différentielle, nous avons identifié deux sous-populations dont nous avons effectué un profilage transcriptomique. Nos données ont révélé que ces deux sous-populations sont clairement distinctes et qu'elles expriment de manière différentielle de nombreux gènes impliqués dans le développement du squelette. Le profil d'expression de ces deux populations les identifie clairement comme des cellules ostéoblastiques. Nous considérons actuellement la population P1 à faible fluorescence comme des cellules précurseurs de type squelettique et la population P2 hautement fluorescente comme des ostéoblastes intermédiaires fonctionnels.
Les protéines ECM revêtent une importance cruciale pour les tissus cartilagineux et osseux. Sur base de leur profil d'expression différentielle dans ces sous-populations, nous avons généré des mutants des gènes codant pour les protéines ECM col10a1a, fbln1 et efemp1 afin d'examiner leurs fonctions. Nos résultats montrent que la mutation de col10a1a entraîne une diminution de la minéralisation, tandis que la mutation de fbln1 entraîne une augmentation de la minéralisation et un opercule manquant. La mutation de efemp1 entraîne une minéralisation accrue et une réduction de l'espace intervertébral, fournissant ainsi un modèle d'arthrose vertébrale. De plus, nous avons étudié les effets de deux probiotiques sur la synthèse et la minéralisation de la matrice osseuse. Nous avons découvert que le traitement probiotique est capable de favoriser la formation osseuse et de prévenir les effets de l'inhibition de la signalisation BMP, Bacillus subtilis étant le plus efficace.
Collectivement, ces informations fournissent des indices précieux qui peuvent contribuer à améliorer la compréhension du rôle des protéines de la matrice extracellulaire et des probiotiques dans le développement, de la croissance et de la santé du squelette osseux.
