Abstract :
[fr] Objectifs: Plus de 34 millions de personnes sont infectées par le virus de l’immunodéficience humaine (VIH) etla majorité d’entre eux (22.5 millions) vit en Afrique Sub-Saharienne. Au Rwanda, où plus de 96000 individus ont eu accès aux antirétroviraux en 2013, la thérapie antirétrovirale de première ligne contient entre autres lesinhibiteurs non nucléosidiques de la transcriptase inverse, éfavirenz (EFV) ou névirapine (NVP). Une grandevariabilité interindividuelle des concentrations plasmatiques en EFV et en NVP a cependant été observée qui estpartiellement due à la forte variabilité génétique du cytochrome P450 2B6 (CYP2B6). Les objectifs de ce travailde thèse ont consisté (i) à identifier de nouveaux polymorphismes ponctuels (SNP) au niveau du gène CYP2B6,dans la population rwandaise (ii) de caractériser leurs effets sur l’activité enzymatique in vitro et in silico, (iii) à déterminer la fréquence des nouveaux SNP et de SNP connus dans une population rwandaise de patients infectés au VIH et (iv) à associer les polymorphismes et les haplotypes qui en étaient déduits aux concentrationsplasmatiques d’EFV, de NVP et de leurs principaux métabolites hydroxylés.Méthodes: Les neufs exons de CYP2B6 de 39 individus rwandais ont été séquencés. Huit nouveaux SNP ont étéexprimés dans des cellules COS-1 et la fonction enzymatique des nouvelles variantes CYP2B6 a été déterminéein vitro par l’intermédiaire des substrats bupropione et EFV. Ces résultats ont été comparés au potentiel prédictif de huit algorithmes. Des analyses de docking et des simulations de dynamique moléculaire à long terme ont décrit des changements de la structure tertiaire du CYP2B6 et du mode de liaison entre le site actif et les substrats de l’enzyme. 19 SNP ont été par la suite génotypés par une méthode de MALDI-TOF et 11 SNP ont étédiscriminés par PCR en temps réel chez 806 individus rwandais. Les concentrations plasmatiques à l’équilibre d’EFV, de NVP et des métabolites 7-OH-, 8-OH-, 8,14-OH EFV et 2-OH, 3-OH NVP ont été quantifiées par LC/MS-MS chez 431 patients rwandais traités par EFV ou NVP. L’effet du génotype sur la distribution desinhibiteurs non nucléosidiques EFV et NVP a été étudié par des tests statistiques univariés et multivariésRésultats: Trois nouveaux SNP [c.548T>G (p.V183G), c.637T>C (p.F213L), c.758G>A (p.R253H)] et cinq SNP dont la fonction n’était pas connue [c.329G>T (p.G110V), c.341T>C (p.I114T), c.444G>T (p.E148D),c.835G>C (p.A279P), c.1459C>A (p.R487S)] ont été identifiés et assignés aux cinq nouveaux allèlesCYP2B6*33 – CYP2B6*37. Les analyses in vitro ont montré que les variantes 148D, 253H, 279P et 487S sontfonctionnelles tandis que la variante 213L a une activité enzymatique réduite et les variantes 110V, 114T et183G sont non-fonctionnelles. 60% à 80% des prédictions de la fonction de chaque variante faites in silicoétaient correctes. Les simulations de dynamique moléculaire à long terme ont montré que les variantes 110V, 114T, 183G et 213L entraînent des modifications structurales au niveau d’hélices alpha et de feuillets beta qui entourent le site catalytique de l’enzyme CYP2B6. La fréquence des huit polymorphismes dans la population rwandaise était <0.9% ce qui les a classé comme variantes rares. 71% des 219 patients sous traitement EFV et 42% des 212 patients traités par NVP présentaient respectivement des concentrations supra- et sub-thérapeutiques. Un nouvel allèle CYP2B6Rwa7 (SNP c.341T>C, c.444G>T et c.835G>C) a été significativement associé à de faibles concentrations en EFV et NVP. L’haplotype TGT (c.516G>T, c.785A>G et g.21563C>T) a été fortementassocié à des concentrations plasmatiques élevées d’EFV et de NVP et à de faibles taux plasmatiques en 8-OHEFV et 3-OH NVP. Le génotype *6/*18, le polymorphisme homozygote g.21563TT ainsi que l’haplotype TGT sous sa forme homozygote ont été identifiés comme les principaux facteurs indépendants responsables des concentrations plasmatiques élevées en EFV.Conclusions: Nous avons décrit trois nouveaux SNP dont deux ont un impact sur la fonction enzymatique du CYP2B6 in vitro et assigné cinq nouveaux allèles CYP2B6 dans la population rwandaise. Nos travaux ont identifié un nouvel allèle CYP2B6 qui a été associé à des concentrations faibles d’EFV et de NVP et confirmé l’existence de marqueurs génétiques permettant de prédire des concentrations supra-thérapeutiques en EFV. Ces résultats suggèrent une stratégie individualisée de génotypage afin de soutenir l’efficacité et la persistance de lathérapie antirétrovirale en Afrique Sub-Saharienne./Objectives: Over 34 million individuals are living worldwide with the human immunodeficiency virus (HIV) and the majority living in Sub-Saharan Africa (22.5 million). In Rwanda, more than 96000 patients were receiving antiretroviral drugs by 2013. The Rwandese first-line treatment is a non-nucleoside reverse transcriptase inhibitor based regimen containing either efavirenz (EFV) or nevirapine (NVP). High interindividual variations in EFV and NVP plasma concentrations have been reported which are partiallycaused by the high genetic variability of the cytochrome P450 2B6 (CYP2B6). The aims of this thesis project were (i) to identify new single nucleotide polymorphisms (SNP) within the CYP2B6 gene, (ii) to characterize in vitro and in silico their effects on the enzyme activity,(iii) to determine the frequency of new and known SNP in HIV-infected patients from Rwanda and (iv) to correlate the SNP/haplotypes with plasma concentrations of EFV, NVP and their main hydroxy metabolites.Methods: The nine CYP2B6 exons of 39 individuals from Rwanda were sequenced. Eight new nonsynonymous SNP were recombinantly expressed in COS-1 cells and the new CYP2B6 variants werefunctionally characterized in vitro using the substrates bupropion and EFV. The results were compared with the functional prediction potency of eight algorithms. Docking and long-term molecular dynamic (MD) simulations were performed to describe structural changes and interaction modifications between the substrates and the CYP2B6 binding pocket. 19 SNP were genotyped with a MALDI-TOF genotyping method and 11 SNP were discriminated with real time PCR in 806 individuals from Rwanda. Steady-state EFV, NVP and their main hydroxy metabolites 7-OH-, 8-OH-, 8,14-OH EFV and 2-OH, 3-OH NVP werequantified using LC/MS-MS in 431 Rwandese patients under EFV or NVP therapy. Uni- and multivariatestatistical analyses were performed to assess the genotype significance in EFV and NVP drug distribution.Results: Three new [c.548T>G (p.V183G), c.637T>C (p.F213L), c.758G>A (p.R253H)] and five uncharacterized non-synonymous SNP [c.329G>T (p.G110V), c.341T>C (p.I114T), c.444G>T (p.E148D), c.835G>C (p.A279P), c.1459C>A (p.R487S)] were identified and five novel alleles termed CYP2B6*33 – CYP2B6*37 were assigned. In vitro analysis revealed that the variants 148D, 253H, 279P and 487S were functional whereas the variant 213L showed a reduced enzyme activity and the variants 110V, 114T and183G were complete loss-of-function variants. 60% to 80% of the in silico functional predictions of each variant were correct. The MD simulations showed that only the variants 110V, 114T, 183G and 213L had structural modifications in alpha-helices and beta-strands surrounding the catalytic site of the CYP2B6 enzyme. The frequency of the eight polymorphisms in the Rwandese population was <0.9% classifying them as rare variants. 71% of 219 EFV-treated patients and 42% of 212 NVP-treated patients had supra- and subtherapeutic plasma concentrations, respectively. A new allele termed CYP2B6Rwa7 (SNP c.341T>C, c.444G>T, c.835G>C) was significantly associated to low EFV and NVP concentrations. The “CYP2B6-TGT” haplotype (c.516T, c.785G, g.21563T) was strongly related to high EFV and NVP and low 8-OH EFV and 3-OH NVP plasma concentrations. The *6/*18 genotype, the homozygous g.21563TT SNP and the homozygous TGT haplotype were found as the most relevant independent factors to account for high EFV concentrations.Conclusions: We have described three novel SNP with two altering the CYP2B6 enzyme function in vitro and assigned five new CYP2B6 alleles in a Rwandese population. Our research work allowed us to identify a new CYP2B6 allele which was correlated to low EFV and NVP concentrations and to confirm the existence of genetic markers predicting supra-therapeutic EFV plasma concentrations. Our results suggest an individualized genotyping strategy to sustain the efficiency and the durability of the antiretroviral therapy in Sub-Saharan Africa.
