Abstract :
[fr] Les pneumonies bactériennes constituent un problème majeur dans l'élevage et l'engraissement des bovins, avec des répercussions très élevées en termes de morbidité et de mortalité. Dans ce contexte, les auteurs sont unanimes pour considérer que l'agent pathogène compliquant principal, voire systématique, est Mannheimia haemolytica, une bactérie qui n'affecte que les ruminants. Parmi les différents facteurs de virulence incriminables, la culpabilité de la leucotoxine s'impose, notamment parce que, ex vivo, elle n'est capable d'induire la nécrose des leucocytes qu'à la condition sine qua non qu'ils soient d'origine bovine, ovine ou caprine. Au niveau moléculaire, cette spécificité est due à une interaction entre la leucotoxine et la beta2-intégrine LFA-1, un récepteur constitué des sous-unités CD11a et CD18.Les objectifs de notre projet étaient (i) d'identifier les différences systématiques qui distinguent les sous-unités CD11a et CD18 des ruminants de celles des autres espèces, (ii) de produire une leucotoxine pure et active, (iii) de cibler la sous-unité du récepteur responsable de la spécificité d’espèce qu’exhibe la leucotoxine de M. haemolytica envers les leucocytes des ruminants et (iv) plus particulièrement, d’identifier le motif moléculaire précis impliqué.Nous avons d’abord cloné, séquencé et caractérisé les CD11a bovin, ovin et caprin, de même que les CD18 ovin et caprin, ce qui nous a permis de les contraster entre eux et avec certains de leurs homologues non ruminants, pour finalement mettre en évidence respectivement 58 et 17 sites de mutation potentiellement responsables de la virulence spécifique de M. haemolytica envers les ruminants. Nous avons ensuite mis au point un protocole de purification de la leucotoxine et vérifié la spécificité de son activité cytolytique in vitro via la réalisation de tests de cytotoxicité et de viabilité cellulaire sur diverses lignées réputées sensibles ou insensibles. Enfin, il est apparu au cours du travail que la sous-unité portant la spécificité de l’effet cytotoxique était le CD18. Nous avons alors évalué d’une part les 15 sites présents dans la région extracellulaire en tentant d’inhiber l’effet de la leucotoxine sur la lignée lymphoblastique bovine BL-3 par l’ajout de peptides dérivés de cette séquence et d’autre part les sites des portions transmembranaire et cytoplasmique en transfectant de manière transitoire la lignée lymphoblastique d’origine humaine K-562, qui n’exprime naturellement aucune beta2-intégrine, avec les récepteurs LFA-1 mutants correspondants. En conclusion, nous avons développé tous les outils nécessaires à l’identification précise du motif moléculaire du CD18 responsable de la spécificité d’espèce de M. haemolytica en excluant l’implication des sites des régions transmembranaire et cytoplasmique.Les perspectives à court terme sont (i) d’évaluer par transfection transitoire les 15 sites répertoriés dans la région extracellulaire du CD18, (ii) de tester des LFA-1 bovins chimériques dont certains domaines spécifiques du CD18 auront été remplacés par leur correspondant humain et (iii) de vérifier le maintien de la capacité de margination et de diapédèse du ou des mutants/chimères sélectionnés. A plus long terme, nous espérons (i) disséminer dans la population bovine des animaux intrinsèquement résistants aux pneumonies bactériennes à M. haemolytica par introgression (si nous parvenons à mettre en évidence un allèle correspondant au(x) mutant(s) sélectionné(s)), ou par transgenèse et/ou (ii) élaborer un jeu de peptides compétiteurs du LFA-1 pour la fixation à la leucotoxine, c’est-à-dire qui seront inhibiteurs de son activité leucotoxique in vitro et de la virulence de M. haemolytica in vivo, le but étant de proposer un peptide thérapeutique injectable à substituer aux traitements antibiotiques ne générant ni résidus ni antibiorésistance et fonctionnant à la manière d’un leurre pour la leucotoxine./Bacterial pneumonias represent the major problem in cattle breeding and fattening, with high morbidity and mortality levels. In this context, Mannheimia haemolytica plays a great role as a complicating agent in ruminant pleuropneumonias. Besides the several virulence factors incriminated, the leukotoxin is held responsible in restricting the disease to ruminants because it does not induce cytolysis of leukocytes from other species ex vivo. At the molecular level, this specificity is due to the tight interaction between leukotoxin and the beta2-integrin LFA-1, a receptor made of CD11a and CD18 subunits.The aims of this work were (i) to identify the systematic differences that distinguish ruminant CD11a and CD18 from their non-ruminant homologues, (ii) to produce an active and purified leukotoxin, (iii) to target the subunit displaying the ruminant-specificity of Mannheimia haemolytica leukotoxin and (iv) to especially identify the concerned molecular motif.First, we have cloned, sequenced and characterized bovine, ovine and caprine CD11a, as well as ovine and caprine CD18, providing the opportunity to contrast ruminant versus non-ruminant LFA-1. This analysis has finally led to the identification of respectively 58 and 17 potential mutation sites that could be the cause of the species-specific virulence of M. haemolytica. Afterwards, we have developed a purification protocol for leukotoxin and checked its specific cytotoxicity in vitro by cellular cytotoxicity and viability tests on several cell lines supposed to be sensistive or insensitive. At last, it appeared during the project that CD18 was necessary and sufficient to mediate the specificity of leukotoxin cytotoxicity. We have then evaluated (i) the extracellular region 15 sites by tempting to inhibit leukotoxin effect on bovine lymphoblastic BL-3 cell line with the addition of peptides mimicking this sequence and (ii) the transmembranous and cytoplasmic sites by transiently transfecting human lymphoblastic K-562 cell line, that naturally express no beta2-integrin, with corresponding mutated LFA-1 receptors.To conclude, we have developed all the tools required to precisely identify the CD18 molecular motif responsible for M. haemolytica species-specificity and we have excluded the implication of transmembranous and cytoplasmic regions.At short term, perspectives are (i) to evaluate by transient transfection the 15 CD18 extracellular region sites, (ii) to test chimeric bovine LFA-1 of which some specific domains would be substituted for by their human homologue and (iii) to check selected mutants or chimeras ability to perform rolling and diapedesis. At longer term, we hope (i) to disseminate in bovine population animals that would become naturally resistant to M. haemolytica pneumonias by introgression (if we could find an allele corresponding to selected mutant(s)) or by transgenesis and/or to elaborate a panel of LFA-1 competing peptides for leukotoxin binding, i.e. that inhibit in vitro leukotoxic activity and in vivo M. haemolytica virulence, with the aim to propose an injectable therapeutic peptide that could be substituted to antibiotics, generating neither residues nor antibioresistance and working as a decoy for leukotoxin.
