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Abstract :
[fr] Le cancer du poumon est un problème majeur de santé publique et dont le coût humain et social est sans cesse en augmentation au cours des dernières années. Parmi les nombreux médiateurs susceptibles de jouer un rôle dans la croissance tumorale, nous avons étudié en détails le système des ADAM et ADAMTS protéases. Les ADAMs sont des enzymes aux fonctionnalités multiples qui interviennent dans de nombreux processus physiologiques et pathologiques. Parmi ces différents processus, certains concernent des modulations de la structure ou de l’état de la matrice extracellulaire et d’autres des boucles d’interactions entre différents types cellulaires reliés par des médiateurs protéiques. Les modulations apportées à ce système par les ADAM protéases résident donc dans l’activation ou l’inhibition de certains processus biologiques par clivage de molécules ou activation des récepteurs. Au cours de la première partie de notre travail, nous avons étudié l’expression de différentes ADAM(TS) protéases sélectionnées sur base de la littérature comme potentiellement impliquées dans la régulation de la croissance tumorale. L'analyse d'échantillons de cancers pulmonaires humains a été réalisée en collaboration avec le Professeur P BIREMBAUT (Unité INSERM U 514, Reims). Nous avons mis en évidence que l’ADAM-12 (forme complète membranaire) est surexprimée et que l’ADAMTS-1 est moins exprimée dans les tissus tumoraux pulmonaires obtenus par résection chirurgicale par rapport à des échantillons correspondants prélevés en zone saine. Ces variations ont été vérifiées par Real-Time PCR et par western blots. Les niveaux d’expression de l’ADAM-12 sont corrélés à l’expression des mRNAs codant pour les isoformes 121 et 165 (qui sont pro-angiogènes) du VEGF-A. Une immunohistochimie marquant l'ADAM-12 a montré une expression de cette protéase principalement dans les cellules tumorales ; l'ADAMTS-1 par contre, est surtout exprimée dans le tissu bronchique sain. Les lignées de cellules pulmonaires issues de cellules épithéliales bronchiques et alvéolaires ont été caractérisées pour leur expression en ADAM-12 et ADAMTS-1. L’ADAM-12 et l’ADAMTS-1 sont surexprimées par les cellules de type BZR et BZR T33 qui forment des tumeurs chez les souris et qui ont un caractère agressif. Au cours de ces travaux, nous avons donc clairement pu identifier deux protéases dont l'expression est modulée dans nos échantillons de tissu pulmonaire sain ou tumoral. L'ADAM-12, surexprimée dans les tumeurs, serait un modulateur « positif » de la progression tumorale et l'ADAMTS-1, dont l’expression est moindre dans les tumeurs semble être un modulateur négatif du développement tumoral (Rocks et al, Br J Cancer, 2006). Nous avons focalisé la suite de nos travaux sur l’étude des effets de l’ADAM-12 et de l’ADAMTS-1 sur différents phénomènes biologiques impliqués dans la progression tumorale.Sur base de l'analyse des échantillons de cancers pulmonaires, l'ADAM-12 est donc apparue comme un candidat potentiel impliqué dans la progression tumorale. Nous avons ainsi généré des clones surexprimant l’ADAM-12 à partir de cellules épithéliales bronchiques immortalisées (BEAS-2B). Ces clones ont été caractérisés et leur production d’ADAM-12 a été démontrée par RT-PCR et cytométrie de flux. Le comportement des cellules surexprimant l’ADAM-12 a ainsi pu être comparé à celui des cellules parentales transfectées avec le vecteur vide (contenant uniquement le gène de la résistance à la néomycine). Différentes expériences in vitro ont été réalisées sur ces cellules. Il ressort de l’ensemble de cette caractérisation que les cellules surexprimant l’ADAM-12 présentent une prolifération et une capacité à former des colonies en agar mou accrues par rapport aux cellules parentales. De plus, les cellules surexprimant l’ADAM-12 ont une sensibilité vis-à-vis de l’apoptose diminuée par rapport aux clones contrôles. Ces processus sont dépendants d’une augmentation de la production d’HB-EGF mature par les clones surexprimant l’ADAM-12. Les clones surexprimant l’ADAM-12 ainsi que les clones contrôle ont été implantés au sein du tissu pulmonaire de souris et injectés dans le tissu sous-cutané. Il ressort de ces expériences que les cellules de type BEAS-2B transfectées ou non par l’ADAM-12 sont peu tumorigènes qu'elles soient implantées dans un site orthotopique (intra-pulmonaire) ou hétérotopique (sous-cutané) dans les souris SCID. En dépit du fait que l'ADAM-12 stimule la prolifération cellulaire et protège les cellules de l’apoptose in vitro, sa surexpression n’est pas suffisante en soi pour développer un phénotype tumorigène in vivo (Rocks et al, Cell Prolif, in press).Dans la troisième partie de notre travail, nous avons généré à partir de la lignée dérivée de cellules épithéliales bronchiques tumorales BZR des clones transfectés de façon stable qui surexpriment l’ADAMTS-1 humaine complète. Ceci est confirmé par la présence de bandes de 87 kDa en Western Blot, représentant la forme complète et active de cette protéase. In vitro, nous n’avons pas pu mettre en évidence de différence de prolifération, de migration, d’invasion et d’apoptose entre les différents clones étudiés. Nous avons ensuite procédé à l’implantation au niveau sous cutané dans des souris immunodéficientes de populations cellulaires transfectées de façon stable avec le gène de l’ADAMTS-1. Nous avons ainsi évalué si la surexpression de cette protéase modifiait le comportement de ces cellules en termes de prolifération in vivo. Les tumeurs formées à partir de cellules transfectées avec la forme complète de l’ADAMTS-1 présentent une taille plus importante que les tumeurs formées à partir de cellules BZR contrôle. Un immunomarquage pour le « Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) » a révélé des scores de prolifération cellulaire plus élevé dans les tumeurs dérivées de populations cellulaires surexprimant l’ADAMTS-1. De plus, l’analyse histochimique des tumeurs a montré, dans les tumeurs surexprimant l’ADAMTS-1, la présence de structures stromales composées de fibronectine (WB), collagène (marquées positivement par coloration au safran, WB) et de myofibroblastes (positifs pour l’alpha-actine des muscles lisses). Afin d’étudier le potentiel chimiotactique de l’ADAMTS-1 sur les fibroblastes, nous avons utilisé le modèle des chambres de Boyden. Les chambres du dessous ont été remplies avec des milieux conditionnés dérivés de populations de cellules transfectées ou non avec la forme complète de l’ADAMTS-1. Les milieux conditionnés de cellules surexprimant l’ADAMTS-1 ont des capacités d’attraction plus importantes sur les fibroblastes que les milieux conditionnés dérivés de cellules contrôles. Cependant, l’ajout d’ADAMTS-1 recombinante au milieu conditionné par des cellules contrôles n’est pas suffisant pour augmenter la migration des fibroblastes. Nous avons donc mesuré l’expression de facteurs potentiellement impliqués dans le remodelage de la matrice extracellulaire et dans la migration de fibroblastes. Les tumeurs surexprimant l’ADAMTS-1 ont des taux plus élevés de MMP-13, TGF-beta;1 et d’IL-1beta;. De plus, un anticorps bloquant les effets du TGF-beta;1 et/ou de l’IL-1beta; diminue la migration des fibroblastes en chambre de Boyden. En résumé, nous montrons par ce travail, que les cellules BZR transfectées au moyen de la forme complète de l’ADAMTS-1, forment des tumeurs plus larges, infiltrées par des myofibroblastes, suggérant que les interactions tumeur-stroma influencent la prolifération de cellules tumoralesEn conclusion, nos travaux ont identifié que l’expression de l’ADAM-12 et l’ADAMTS-1 est modulée dans des tumeurs bronchiques humaines. L’ADAM-12 joue un rôle dans la prolifération cellulaire en activant le clivage de facteurs de croissance membranaires qui sont des ligands de l’EGFR. Le rôle de l’ADAMTS-1 apparaît comme beaucoup plus complexe et nos travaux montrent que l’ADAMTS-1 peut influencer la croissance tumorale in vivo en modulant la composition cellulaire et matricielle du stroma. Collectivement, ces travaux confirment le rôle clé joué par les protéases de la famille des ADAMs et ADAMTS dans le développement du cancer et identifient ces enzymes comme des cibles thérapeutiques potentielles.
