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Abstract :
[fr] La pododermatite aseptique diffuse, connue sous le nom de fourbure, consiste en un état inflammatoire des tissus lamellaires du pied. Elle se traduit par un défaut d’attachement entre la phalange distale et la face interne de la muraille du pied et par l’apparition d’une boiterie caractéristique. Le coût émotionnel et économique de la fourbure, associé aux connaissances encore limitées de sa pathophysiologie et des moyens de traitement ou de prévention, rend cette maladie particulièrement frustrante pour les vétérinaires et les propriétaires. La fourbure reste une complication importante de nombreuses maladies médicales et chirurgicales du cheval. Elle est le plus souvent associée aux facteurs alimentaires (pâturage intensif, coliques, obésité), aux traumas de la région digitée ainsi qu’aux états hypovolémiques et septiques. Histologiquement, la fourbure se caractérise par la destruction de la membrane basale et le désengrènement subséquent du derme et de l’épiderme lamellaire.Deux grandes théories ont été avancées pour expliquer la fourbure. Dans la première, une chute de la perfusion sanguine du pied conduirait à une nécrose de l’interface lamellaire en réponse à un phénomène d’ischémie-reperfusion. Dans la seconde théorie, les facteurs déclencheurs de la fourbure seraient drainés par la voie vasculaire jusque dans le pied où ils induiraient la production et l’activation des métalloprotéinases matricielles (MMP) à l’origine de la destruction de la membrane basale. Plus récemment, les troubles endocriniens à l’origine de résistance à l’insuline ont aussi été reconnus comme une importante cause de fourbure.A partir des éléments connus de la pathophysiologie de la fourbure, il nous a semblé que les cellules endothéliales, les kératinocytes et les neutrophiles pourraient jouer un rôle prépondérant dans la pathophysiologie complexe de cette maladie. L’objectif général de ce travail était donc de préciser les rôles de la myéloperoxydase (MPO) et de l’élastase du neutrophile dans la fourbure et ce, particulièrement au niveau des interactions du neutrophile avec les cellules endothéliales et les kératinocytes. Les travaux de cette thèse ont conduit à la mise au point d’un système de dosage de l’élastase du neutrophile équin. En raison de la grande quantité de sang que demande la purification de la MPO et de l’élastase, nous avons d’abord élaboré une technique permettant la purification des 2 enzymes à la fois. Pour ce faire, la MPO et l’élastase ont été purifiées par une double étape de chromatographie en phase liquide à partir de neutrophiles isolés du même pool sanguin. L’élastase purifiée a ensuite été utilisée pour la production d’anticorps anti-élastase par immunisation chez le lapin et le cobaye. Les anticorps disponibles ont permis le développement et la validation d’un test ELISA pour la mesure de l’élastase équine, d’abord dans le plasma puis dans d’autres fluides biologiques. Les méthodes de dosage de la MPO et de l’élastase ont été appliquées dans un modèle expérimental de fourbure induite par administration orale d’extraits de noyer noir (BWHE). Les résultats indiquent une augmentation significative de la concentration plasmatique en MPO et en élastase pendant la phase prodromique de la fourbure, plus précoce pour la MPO que pour l’élastase. Dans les tissus lamellaires et dans la peau, une augmentation significative de la MPO et de l’élastase est aussi enregistrée dès 3h après l’administration de BWHE. L’activité enzymatique de la MPO mesurée par SIEFED (Specific Immuno-Extraction Followed by Enzymatic Detection) est, quant à elle, significativement plus élevée chez les animaux traités que chez les contrôles dès 1,5h après l’induction. L’immunohistochimie de la peau et des tissus lamellaires confirme l’infiltration de la MPO et de l’élastase pendant la phase prodromique de la fourbure et indique une forte affinité de ces enzymes pour le tissu épidermique.Notre étude préliminaire sur des fourbures naturelles hospitalisées dans notre clinique indique une concentration en élastase plasmatique significativement plus élevée chez les chevaux fourbus que chez les chevaux du groupe témoin et confirme les résultats obtenus dans le modèle expérimental. D’autre part, sur le plan clinique, nos travaux ont mis en évidence l’efficacité de l’administration d’une héparine de bas poids moléculaire (LMWH), l’énoxaparine, dans la prévention des fourbures postopératoires chez les chevaux en coliques. Nos modèles de culture cellulaire in vitro nous ont appris que les cellules endothéliales issues de l’extrémité distale du membre sont capables de fixer la MPO en solution et que la MPO associée aux cellules conserve une activité enzymatique. Par ailleurs, la présence d’héparine classique et de LMWH dans le milieu, réduit de manière significative la capture de MPO par les cellules endothéliales et l’activité enzymatique associée aux cellules. De plus, bien que les cellules artérielles semblent capter davantage la MPO que les cellules veineuses, l’inhibition de cette capture par les héparines semble plus efficace sur les cellules veineuses. En utilisant le SIEFED comme outil pharmacologique dans un modèle acellulaire, héparine classique et LMWH ont montré leur aptitude à inhiber l’activité de la MPO. Cette inhibition, meilleure à basse concentration pour l’héparine classique, est plus prononcée à plus forte concentration pour les LMWH. Une étude immunocytologique préliminaire menée sur des kératinocytes équins en culture (issus de la bande coronaire) confirme l’affinité de la MPO en solution pour ces cellules. Enfin, dans un modèle de culture de cellules endothéliales équines issues de carotides, nous avons montré par oxygraphie, chromatographie en phase gazeuse et résonance paramagnétique électronique, que l’anoxie-réoxygénation entraîne une altération de la fonction respiratoire de ces cellules et provoque une augmentation significative de leur production d’espèces réactives de l’oxygène, créant ainsi des conditions favorables au fonctionnement enzymatique de la MPO fixée sur les cellules endothéliales. Nos travaux permettent d’incriminer le recrutement et l’activation du neutrophile dans la pathophysiologie de la maladie. La MPO et l’élastase représentent respectivement le versant oxydant et protéolytique du neutrophile et leur présence dans la phase prodromique de la fourbure suggère un rôle de ces enzymes dans les évènements qui contribuent au développement de la maladie. L’effet modulateur de LMWH sur l’activité des neutrophiles et de leurs enzymes, ainsi que sur les interactions des neutrophiles avec l’endothélium, pourrait ainsi intervenir dans la prévention de la fourbure.Nos travaux, associés aux publications de la dernière décennie, suggèrent aussi que les théories vasculaire et enzymatique de la fourbure sont inextricablement liées l’une à l’autre comme les caractéristiques d’un syndrome de réponse inflammatoire systémique dont la défaillance organique ou multi-organique se traduit principalement, chez le cheval, par la séparation des tissus lamellaires. La réponse inflammatoire semble ainsi se situer au carrefour des fourbures liées au sepsis et de celles relatives aux désordres endocriniens. Dans le futur, le contrôle de l’activation et du recrutement des neutrophiles et la protection de l’endothélium devraient constituer des avancées stratégiques pour enfin traiter et prévenir la fourbure équine de manière efficace/Diffuse aseptic pododermatitis, known as laminitis, is an inflammatory condition of the hoof laminar tissues. It consists in default of attachment between the third phalanx and the inner hoof wall and results into a characteristic lameness. The emotional and economic cost of laminitis, coupled with our limited knowledge of its pathophysiology and the means of prevention or treatment, makes this disease particularly frustrating for veterinarians and owners.Laminitis is an important complication of many equine medical and surgical diseases. It is most often associated with dietary factors (intensive grazing, colic, obesity), trauma to the digital region and to the hypovolemic and septic states. Histologically, laminitis is characterized by the destruction of the basement membrane and the subsequent disengagement of the dermal and epidermal lamina.Two main theories have been advanced to explain laminitis. In the first one, a drop of blood perfusion of the foot would lead to necrosis of the lamellar interface in response to an ischemia-reperfusion phenomenon. In the second theory, the laminitis trigger factors would be drained into the foot through hematogenous pathway causing the production and activation of matrix metalloproteinases (MMP). This would result into the destruction of the basement membrane. More recently, endocrine disorders resulting in insulin resistance have also been recognized as an important cause of laminitis.From what is known about the pathophysiology of laminitis, it seemed that the endothelial cells, keratinocytes and neutrophils may play a role in the complex pathophysiology of this disease. The overall objective of this study was to clarify the roles of myeloperoxidase (MPO) and neutrophil elastase in laminitis, particularly at the level of neutrophil interactions with endothelial cells and keratinocytes. The works of this thesis have led to develop a mean of determination of neutrophil equine elastase. Due to the large amount of blood required for the purification of MPO and elastase, we first developed a technique for the purification of both enzymes. MPO and elastase were purified by a double step liquid chromatography from neutrophils isolated from the same pool of blood. The purified elastase was then used for the production of anti-elastase antibodies by immunizing rabbits and guinea pigs. The available antibodies have enabled the development and validation of an ELISA for measurement of equine elastase, first in the plasma and then in other biological fluids. The methods for MPO and elastase assay have been applied in an experimental model of laminitis induced by oral administration of black walnut heartwood extract (BWHE). The results indicate a significant increase in plasma concentration of MPO and elastase during the prodromal stage of laminitis, earlier for MPO than for elastase. In the skin and the lamellar tissues, a significant increase of MPO and elastase is also registered as early as 3h after administration of BWHE. The enzymatic activity of MPO measured by SIEFED (Specific Immuno-Extraction Followed by Enzymatic Detection) is, in turn, significantly higher in treated animals than in controls as early as 1.5 h after induction. Immunohistochemistry of the skin and lamellar tissues confirms the infiltration of MPO and elastase during the prodromal stage of laminitis, indicating a strong affinity of these enzymes for the skin tissue.Our preliminary study on naturally occurring laminitis in horses hospitalized in our clinic indicates a significantly higher plasma elastase concentration in foundered horses than in control horses and confirms the results obtained in the experimental model. Additionally, we clinically demonstrated the effectiveness of the administration of a low molecular weight heparin (LMWH), enoxaparin, in preventing postoperative laminitis in horses suffering from colic.Our in vitro cell culture models taught us that endothelial cells from the distal limb are able to bind MPO in solution and that cell-associated MPO retains enzymatic activity. Moreover, the presence of conventional heparin and LMWH in the medium significantly reduces the uptake of MPO by endothelial cells and the enzyme activity associated with cells. Furthermore, although the arterial cells seem to capture more MPO than venous ones, inhibition of this uptake by heparins appears to be more effective on venous cells. Using the SIEFED as pharmacological tool in a cell-free model, heparin and LMWH showed their ability to inhibit MPO activity. This inhibition is better at low-concentration for heparin and is conversely more pronounced at higher doses for LMWH. A preliminary immunocytochemical study on equine keratinocytes cultured from the coronary band cells confirms the affinity of MPO in solution for these cells. Finally, in a model of equine endothelial cells, cultured from the carotid artery, we showed by oxygraphy, gas chromatography and electron spin resonance, that anoxia-reoxygenation leads to an impaired respiratory function of the cells and causes their production of reactive oxygen species to significantly increase, thereby creating favorable conditions for the functioning of MPO enzyme attached to the endothelial cells. Our works incriminate the neutrophil recruitment and activation in the pathophysiology of laminitis. MPO and elastase respectively represent the oxidative and proteolytic side of neutrophils. Their presence in the prodromal phase of laminitis suggests a role for these enzymes in the events that contribute to the disease development. The modulating effect of LMWH on the activity of neutrophils, their enzymes and their interactions with the endothelium, could intervene in the prevention of laminitis. Our work, related to publications of the last decade, also suggest that the enzymatic and vascular theories of laminitis are inextricably linked to each other as they characterize a systemic inflammatory response syndrome associated with organ failure, which, in the horse, mainly translates into the separation of lamellar tissue. Inflammatory response seems to be at the crossroads of sepsis-related laminitis and those related to endocrine disorders. In the future, control of the neutrophil activation and recruitment and protection of the endothelium should become strategic steps to effectively treat and prevent equine laminitis.
