Abstract :
[fr] La perte du vecteur gravitationnel expérimentée par les spationautes lors de missions dans l’espace a un impact manifeste sur la physiologie et l’homéostasie de plusieurs systèmes de l’organisme. La compréhension des perturbations engendrées par la mise en apesanteur nécessite une détermination précise des mécanismes cellulaires et moléculaires potentiellement altérés. Les nombreuses observations réalisées au cours d’expériences spatiales in vitro concordent pour désigner le cytosquelette comme cible privilégiée de la microgravité. Nous avons largement décrit dans l’introduction de notre mémoire les mécanismes de mécano-réception et mécano-transduction mettant en jeu le continuum physique intégrines-adhésions focales-cytosquelette, ainsi que les régulations opérées par les forces mécaniques sur le phénotype et les fonctions cellulaires. Les petites GTPases de la famille Rho ayant une fonction essentielle dans ces processus, notre hypothèse de travail cible leur implication dans la perception et la réponse cellulaire à la perte du vecteur gravité. Notre stratégie a consisté à explorer cette hypothèse à l’aide de lignées cellulaires d’une part, ostéoblastiques (MG-63), dont l’expression des trois RhoGTPases principales (RhoA, Rac1 et Cdc42) est invalidée par ARN interférentiel, et d’autre part, fibroblastiques (WI-26), également invalidées pour les mêmes RhoGTPases ou exprimant de manière stable leurs formes constitutivement activées. En première approche, la réactivité des MG63 aux stimuli mécaniques a été étudiée dans un modèle expérimental à l’aide d’un Flexercell permettant un étirement biaxial et cyclique des cellules par déformation du support (partie 1 du mémoire). Ces lignées cellulaires ont été utilisés au cours de la mission spatiale CONNECT2 à bord de la capsule Foton lancée par un Soyuz M3 (partie 2 du travail) et le seront prochainement lors de l’expérience CYTOSKELETON dans le Biolab du module Colombus de l’ISS. Lors de l’expérience CONNECT2, les contraintes de temps et de transport des cultures de cellules depuis notre laboratoire vers le site de lancement de la capsule Foton à Baïkonour soulevaient des problèmes potentiels de survie cellulaire et/ou de modifications phénotypiques, notamment liés aux variations de température subies par les cellules avant la mise sur orbite. Les altérations cellulaires induites par une transition de 25°C à 37°C ont donc été investiguées en détail. Nos résultats indiquent que cette transition thermique affecte largement l’expression génique et la survie cellulaire, et induit la production de radicaux libres responsables de dommages à l’ADN. Ils font l’objet de la troisième partie du manuscrit. Ces résultats ont conditionné le plan expérimental de notre future expérience CYTOSKELETON sur l’ISS. En particulier, ils nous ont conduits à développer avec l’ESA et l’industrie un système de cryopréservation des cellules en monocouche et leur décongélation sur l’ISS. Cette technologie présente de nombreux avantages tant pour l’amélioration des conditions expérimentales que pour l’implication de l’équipage dans l’expérience. Les nombreuses mises au point requises par cette mission sont résumées dans la quatrième partie de ce mémoire.Enfin, dans un dernier volet, les résultats d’une étude in vivo sur l’effet d’un séjour prolongé en microgravité sur la physiologie de la peau de souris maintenues pendant 3 mois à bord de l’ISS sont présentés. Par rapport à des souris à 1g au sol, une proportion anormalement élevée de follicules pileux en stade de croissance anagène ainsi qu’une réduction significative de l’épaisseur du derme ont été observés. Ceci suggère l’induction d’une atrophie cutanée par les conditions spatiales. Par ailleurs, les résultats de l’analyse transcriptomique du tissu cutané par microarray indiquent un accroissement très significatif de l’expression d’un grand nombre de gènes impliqués dans la fonction des muscles striés, la glycogénolyse et la transition muscle lent-muscle rapide probablement au niveau du panniculus carnosus sous-hypodermique. Ces effets pourraient dépendre de la surexpression de deux facteurs myogéniques, MEF2C et la myogénine.----------------------------------------Loss of gravitational vector as experienced by astronauts during space missions has an obvious impact on physiology and homeostasis of several organic systems. Understanding weightlessness-induced perturbances requires a precise determination of the potentially altered cellular and molecular mechanisms. A large number of observations during in vitro space experiments designate the cytoskeleton as privileged target of microgravity. We have widely described in the introduction of our thesis the mechanisms of mechano-reception and mechano-transduction that involve the physical continuum formed by integrins, focal adhesions and the cytoskeleton as well as the regulations operated by mechanical forces on cell phenotype and functions. Small GTPases of the Rho family playing a central role in these processes, our working hypothesis aimed at evaluating their involvement in the sensing and cellular reactivity to the loss of gravity.Our strategy was to explore this hypothesis by using osteoblastic (MG63) cell lines that are invalidated for the expression of the three archetypal RhoGTPases (RhoA, Rac1 et Cdc42) by small interfering RNA or fibroblastic (WI26) cell lines similarly invalidated for the same RhoGTPases or stably transfected by vectors expressing their constitutively activated forms. As a first approach, the reactivity of MG63 cell lines to mechanical stimuli was investigated in an experimental model using a Flexercell allowing to submit cells seeded on deformable membrane to a cyclic biaxial strain (part 1 of the thesis). These cell lines have been used during the space mission CONNECT2 onboard of the vessel Soyuz M3 (part 2 of the thesis) and will be also used during the future experiment CYTOSKELETON in the Biolab of the Columbus module in the ISS.During the experiment CONNECT2, time and transportation constraints of the cell cultures from our laboratory to the launch pad of the Foton capsule in Baïkonour raised potential problems of cell survival and/or phenotype alterations, notably due to temperature variations before orbiting. Cellular alterations induced by a 25°C to 37°C transition have been therefore thoroughly investigated. Our results indicate that this thermal transition significantly affects gene expression and cell survival, and induces reactive oxygen species production that are responsible for DNA damage. These results are presented in the third part of the manuscript. These results have conditioned the experimental plans of our future mission CYTOSKELETON on the ISS. Notably, they lead us to develop, in collaboration with ESA and industry, a system of cryopreservation of cells in monolayer and their thawing on the ISS at the time of experiment. This technology presents numerous advantages not only by improving experimental conditions but also for facilitating the work of the crew. The large number of technical adjustments required by this experiment are summarized in the fourth part of the thesis.Finally, the last part of the manuscript describes the results of an in vivo study on the effects of a prolonged exposure to microgravity on skin physiology in mice that stayed 3 months in ISS. As compared to mice at 1g on earth, we observed an abnormally increased proportion of hair follicles in anagen growing stage and a significant reduction of dermal thickness suggesting the induction of a cutaneous atrophy in space conditions. Moreover, transcriptomic analysis by microarray indicates a very significant overexpression of a large number of genes involved in striated muscles function, glycogenolysis and a slow to fast muscle transition probably occurring in the subjacent hypodermis panniculus carnosus. These alterations might depend upon the overexpression of two transcription factors involved in myogenesis, MEF2C and myogenin.
