Abstract :
[fr] L’administration intraveineuse de substances actives peptidiques présente plusieurs difficultés liées à leur instabilité, leur élimination rapide de la circulation sanguine et leur forte sensibilité à la dégradation enzymatique. Le peptide Print3G est un antagoniste d’une oncoprotéine impliquée dans le cancer du sein. L’objectif du travail était de développer des vecteurs liposomaux pour une administration intraveineuse du peptide, capables d’améliorer sa stabilité sanguine et de lui permettre d’atteindre sa cible tumorale. Dans la première partie du travail, deux formulations de liposomes, dites « classiques », ont été étudiées. La première formulation contient du PEG2000, connu pour former une barrière hydrophile et stérique autour du liposome contre l’opsonisation et permettant d’obtenir des liposomes furtifs. La présence du PEG à la surface des vésicules pourrait toutefois diminuer leur capacité de pénétration cellulaire, c’est pourquoi la seconde formulation de liposomes développée contient du PEG750. De plus petite masse moléculaire, il pourrait permettre de maintenir une interaction suffisante avec la membrane cellulaire et constituer un compromis entre rémanence vasculaire prolongée et pénétration cellulaire efficace. Une méthode de dosage CLHP du peptide Print3G a été développée et validée. Celle-ci a non seulement permis d’évaluer la stabilité du peptide mais aussi de connaître précisément son taux d’encapsulation dans les différentes formulations de liposomes développées. L’instabilité du peptide Print3G en solution aqueuse a été mise en évidence, conduisant à la préparation des formulations de manière extemporanée et à l’étude de cryoprotection des liposomes, dans la perspective de lyophiliser les vecteurs pour en améliorer la stabilité. L’encapsulation du peptide Print3G dans les liposomes classiques a été réalisée grâce à la méthode des cycles de congélation-décongélation pour éviter l’adsorption du peptide sur les différents matériaux utilisés lors de la fabrication. Cette méthode a été optimisée au moyen d’un plan d’expériences qui a permis d’atteindre de bons taux d’encapsulation du peptide dans les deux types de liposomes classiques. La seconde partie du travail a été consacrée à l’étude de la pénétration cellulaire des liposomes et de leur contenu. Deux études préliminaires ont dû être développées et validées afin de ne pas engendrer de toxicité due à la contamination microbienne et à la présence de solvant résiduel. Les liposomes classiques contenant des PEG2000 ont montré une faible pénétration cellulaire, ce qui a conduit à l’abandon de cette formulation pour vectoriser le peptide Print3G. Une troisième formulation de liposomes, dits « pH-sensibles » a été caractérisée en termes de taille, de taux d’encapsulation et de stabilité en fonction de la température. Elle a été développée dans le but de libérer efficacement le matériel encapsulé dans le cytoplasme des cellules. Lors de la pénétration cellulaire par endocytose, l’acidification de l’endosome permet de déstabiliser le liposome pH-sensible qui peut ensuite libérer le matériel encapsulé dans le cytoplasme, en évitant sa dégradation par les enzymes lysosomales. Les liposomes pH-sensibles développés contiennent également du CHOL et des PEG750, ajoutés pour maintenir une rémanence vasculaire suffisante. Une étude de la libération du matériel encapsulé dans les liposomes pH-sensibles en fonction du pH a d’abord permis de mettre en évidence le maintien d’une activité pH-sensible malgré la présence de PEG750 et de CHOL dans la formulation. Ensuite, les études réalisées en microscopie confocale et en cytométrie de flux ont permis de montrer la pénétration cellulaire plus importante des liposomes pH-sensibles par rapport aux liposomes classiques, et surtout de mettre en évidence leur capacité à libérer une molécule modèle hydrophile encapsulée dans la cavité interne du liposome. Cet avantage pourrait être expliqué par l’emploi de PEG750, permettant de maintenir l’interaction entre la membrane cellulaire et une sensibilité au pH suffisante. Cette hypothèse a été confirmée lors des études de pénétration cellulaire des vecteurs encapsulant le peptide Print3G biotinylé. Alors qu’il a seulement pu être localisé dans le cytoplasme des cellules cancéreuses traitées avec des liposomes classiques, sa présence dans le noyau a pu être détectée lors de l’utilisation de la formulation pH-sensible. Dans la troisième partie du travail, nous avons pu montrer l’accumulation passive des liposomes pH-sensibles et classiques contenant du PEG750 dans la tumeur solide, sur modèle CAM et sur modèle murin. Cette accumulation, observée jusque dans le cytoplasme des cellules tumorales, était plus importante que dans le foie, la rate et les reins et aucune différence significative entre les deux formulations n’a pu être mise en évidence. Toutefois, les deux modèles in vivo utilisés sont immunodéficients et ne permettent donc pas d’évaluer la résistance à l’opsonisation des liposomes. Une étude de l’interaction des liposomes avec une protéine globulaire modèle, la BSA, a montré la faible adsorption de celle-ci à la surface des liposomes. L’utilisation du PEG2000 par rapport au PEG750 n’a pas permis de diminuer l’interaction du liposome avec la BSA. Grâce à ces résultats, nous pourrions nous attendre à une rémanence vasculaire acceptable des formulations étudiées. Mais pour s’en assurer, l’interaction de ces liposomes avec d’autres protéines et la résistance à l’opsonisation des vecteurs devraient être étudiées. L’ensemble de nos travaux a donc permis de développer et de sélectionner une formulation de liposomes capable de délivrer le peptide Print3G dans le cytoplasme des cellules, de s’accumuler dans la tumeur solide et de présenter une stabilité vraisemblablement acceptable dans le compartiment sanguin. / Intravenous administration of peptide drugs presents several drawbacks, related to their instability, their rapid elimination from the blood circulation and their enzymatic degradation. Print3G is an antagonist of onconprotein involved in breast cancer. The purpose of this work was to develop liposomal vectors for Print3G delivery that are able to improve its blood stability and to deliver it to its site of action.The first part of this work was devoted to the study of the two “classical” formulations of liposomes. The first one contains PEG2000, which forms a steric and hydrophilic barrier on vesicle surface against opsonisation, in order to obtain stealth liposomes. However, PEG could hamper the cellular penetration of liposomes and the second formulation contains PEG750 in order to maintain a sufficient interaction between the cellular membrane and the vesicle. This second formulation could constitute a compromise between prolonged vascular remanence and efficient cellular penetration. An HPLC method was developed and validated for Print3G determination, allowing the evaluation of its stability and its encapsulation efficiency in liposomes. Because of Print3G instability, it was necessary to prepare Print3G aqueous solutions and formulations extemporaneously. This instability also led to the liposomal cryoprotection study in order to further lyophilize formulations. Print3G encapsulation in classical liposomes was obtained using freeze-thawing cycles to avoid its adsorption on manufacture materials. This method was optimized using an experimental design in order to attain good encapsulation efficiency. The second part of the work was to study cellular penetration of liposomes and of their encapsulated material. Two preliminary studies were developed and validated in order to avoid any toxicity due to microorganisms proliferation or presence of residual solvent. A third formulation of liposomes, named “pH-sensitive”, was characterized in terms of size, encapsulation efficiency and temperature stability. pH-sensitive liposomes were developed in order to efficiently deliver the encapsulated material in cell cytoplasm. During cellular internalization by endocytosis, endosome acidification allows to destabilize pH-sensitive liposome which can further deliver its encapsulated material to cell cytoplasm, avoiding its degradation by lysosomal enzymes. The formulation of pH-sensitive liposomes also contains CHOL and PEG750, added to maintain a sufficient vascular remanence. A stability study as a function of the pH allowed observing that the release of encapsulated material is maintained under acidic conditions. CLSM and FACS studies allowed demonstrating the higher cellular penetration of pH-sensitive liposomes comparing to classical ones and, most importantly, their capacity for delivering a hydrophilic model molecule encapsulated in the inner cavity of liposomes. This observation could be explained by the use of PEG750 which could maintain the interaction with cellular membrane and a sufficient pH-sensitivity.This hypothesis was confirmed when the intracellular fate of Print3G encapsulated in liposomes was studied. While it has only been localized in the cytoplasm of cancer cells treated with conventional liposomes, its presence in the nucleus could be detected when using the formulation of pH-sensitive liposomes.In the third part of the work, we showed the passive accumulation in solid tumor of classical and pH-sensitive liposomes containing PEG750 in CAM and mouse models. This accumulation, observed in the cytoplasm of tumor cells, was higher than accumulation in liver, spleen and kidneys. No significant difference could be demonstrated between the two formulations.
