Abstract :
[en] Over the past few years there has been a growing interest in chiral analysis of amino acids (AAs) since several D-forms are thought to play a major role in a number of neurodegenerative diseases. Research in this field is strongly connected to progress in analytical methodology with regard to speed of analysis, sensitivity, high separation performance and simplicity of sample preparation. In this research work, chiral analysis of AAs by MEKC has been studied using both direct and indirect approaches coupled with the full automation of in-capillary derivatization procedure. In the first part of this work, a dual CD-CZE method was developed for the separation of 9-fluoroenylmethyl chloroformate (FMOC) labeled AAs. Firstly, a background electrolyte (BGE) composed of 30 mM beta;-CD, 30 mM octakis(2,3-dihydroxy-6-O-sulfo)-gamma;-CD (OS-gamma;-CD), 40 mM tetraborate and 15% isopropanol (IPA) was selected and led to 17 baseline resolved pairs and 2 partially resolved pairs. Experimental conditions for in-capillary derivatization were then optimized. The best labelling conditions were obtained using successive hydrodynamic injections (30 mbar) of AAs for 2 s, borate buffer for 4 s and 10 mM FMOC solution for 6 s, followed by a mixing at 3 kV for 72 s and wait time of 1 min. The use of MEKC, by adding SDS as surfactant led to the best separation of a standard mixture of ten AA racemates using a BGE containing 30 mM beta;-CD, 30 mM OS-gamma;-CD, 25 mM SDS, 40 mM sodium tetraborate and 17% IPA.In the second part of this work, an original MEKC method using in-capillary derivatization with (-)-9-fluoroenylethyl chloroformate (FLEC) as chiral labelling reagent was developed for the separation of AA derivatives. Several parameters for in-capillary derivatization and MEKC separation were investigated using experimental designs. Efficient labelling was achieved by sequential injection of AAs and FLEC labelling solution followed by the application of a voltage of 0.2 kV for 570 s. Compared to off-line derivatization, in-capillary relative derivatization rates were higher than 82.3 % and better reproducibility was observed. The BGE composition was then optimized in order to achieve selectivity. Separation of 29 in-capillary labeled FLEC-AA derivatives was achieved in a single run using a buffer made up of 40 mM sodium tetraborate, 21 mM SDS and 8.5% IPA. Finally, the quantitative performance of the optimized in-capillary MEKC method was evaluated showing appropriate linearity, accuracy and precision. The developed method was successfully applied to the analysis of spiked artificial cerebrospinal fluid sample./Au cours des dernières années, il y a eu un intérêt croissant pour l'analyse chirale d’acides aminés (AAs) depuis que plusieurs D-AAs sont supposés jouer un rôle majeur au niveau de certaines maladies neurodégénératives. La recherche dans ce domaine est fortement liée aux progrès dans les méthodes d'analyse, notamment en termes de vitesse d'analyse, de sensibilité, de haute performance de séparation et de simplicité de préparation des échantillons. Dans ce travail de recherche, l'analyse chirale d’AAs par chromatographie électrocinétique micellaire (MEKC) a été étudiée en utilisant des approches à la fois directes et indirectes associées à l'automatisation complète de la procédure de dérivatisation à l’intérieur du capillaire. Dans la première partie de ce travail, une méthode par électrophorèse capillaire de zone, associant deux cyclodextrines (CDs), a été développée pour la séparation d’AAs dérivatisés avec le chloroformiate de 9-fluoroénylméthyl (FMOC). Une solution d’électrolytes, composée de 30 mM de beta;-CD, 30 mM d’octakis (2,3-dihydroxy-6-O-sulfo)-gamma;-CD (OS-gamma;-CD), 40 mM de tétraborate de sodium et 15% d’isopropanol (IPA) a été sélectionnée et a conduit à la résolution complète de 17 paires et la résolution partielle de 2 paires de FMOC-AA. Les conditions expérimentales pour la dérivatisation dans le capillaire ont ensuite été optimisées. Les meilleures conditions de dérivatisation ont été obtenues en utilisant des injections hydrodynamiques successives (30 mbar) de la solution d’AA pendant 2 s, du tampon borate pendant 4 s et de la solution de 10 mM de FMOC pendant 6 s, suivies par un mélange en appliquant un voltage de 3 kV pendant 72 s et un temps d'attente de 1 min. L'utilisation de la MEKC, en ajoutant du dodécylsulfate de sodium (SDS) comme agent tensioactif, a conduit à la meilleure séparation d'un mélange de dix racémates d’AAs au moyen d’une solution d’électrolytes contenant 30 mM de beta;-CD, 30 mM d’OS-gamma;-CD, 25 mM de SDS, 40 mM de tétraborate de sodium et 17% d'IPA. Dans la deuxième partie de ce travail, une méthode originale utilisant la MEKC couplée à la dérivatisation dans le capillaire, avec le chloroformiate de (-)-9-fluoroényléthyl (FLEC) comme réactif de dérivatisation chiral, a été développée pour la séparation des dérivés d’AAs. Plusieurs paramètres de dérivatisation dans le capillaire et la séparation par MEKC ont été étudiés en utilisant la méthodologie des plans d’expériences. Une dérivatisation efficace a été obtenue par l’injection séquentielle de la solution d’AA et la solution de FLEC suivies par l'application d'un voltage de 0,2 kV pendant 570 s. Les taux de dérivatisation relatifs calculés pour la dérivatisation dans le capillaire, par rapport à la dérivatisation hors ligne, étaient supérieurs à 82,3% avec une meilleure reproductibilité. La composition de la solution d’électrolytes a ensuite été optimisée afin d'obtenir une bonne sélectivité. La séparation de 29 dérivés de FLEC-AA, dérivatisés dans le capillaire, a été atteinte en une seule analyse en utilisant un tampon constitué de 40 mM de tétraborate de sodium, 21 mM de SDS et 8,5% d'IPA. Enfin, les performances quantitatives de la procédure de dérivatisation dans le capillaire et de la méthode de séparation optimisée ont été évaluées montrant une linéarité, une exactitude et une précision appropriées. La méthode développée a été appliquée avec succès à l'analyse d’un échantillon de liquide céphalo-rachidien artificiel enrichi avec des AAs.
