Abstract :
[en] In the so-called induced systemic resistance phenomenon (ISR), some non pathogenic rhizobacteria are able to stimulate defence mechanisms in the host plant thereby rendering it less susceptible to subsequent phytopathogen attack. This immunization process is initiated into the plant following the perception of elicitors (or determinants) produced by the beneficial microorganism. Previous studies performed in our laboratory have demonstrated the ability of Pseudomonas putida strain BTP1 and Bacillus subtilis strain S499 (or M4) at triggering ISR. By using these two rhizobacteria, the global objective of this thesis is to contribute to a better understanding of this molecular dialogue between ISR-inducing bacteria and plant cells.Our first researches with BTP1 led to the isolation, as an elicitor, of a new compound produced by Pseudomonas. It was purified from bacterial culture supernatant and identified as a benzylamine core alkylated with two methyl and one tetradecyl groups, conferring its hydrophobic properties. On the basis of this structure, the BTP1 determinant was called NABD, for N-Alkylated Benzylamine Derivative. By testing the pure molecule or mutant strains altered in its production, we have shown that NABD was mainly responsible for ISR-activity of the BTP1 strain on bean and cucumber while in tomato, another unidentified compound could also be involved. In the case of Bacillus subtilis S499, we used similar approaches to demonstrate for the first time that the lipopeptides surfactin and fengycin may act as elicitors to stimulate systemic resistance, thereby attributing them a new role in the biocontrol of plant diseases. Structure/activity studies have revealed the implication of the benzylamine aromatic core in the biological activity of NABD. In the case of surfactin, reduced activity of some homologues indicates that its perception is dictated by structural clues such as the length of the acyl moiety and the presence of charges in the cyclic peptide part.Also in support to their involvement in ISR triggering, significant quantities of NABD and lipopeptides were recovered from the rhizosphere of bacterized plants. The influence of some physiological and physico-chemical factors on NABD production by BTP1 was further investigated in in vitro experiments. Our results show that the molecule is more efficiently produced at low cell growth rate and in the presence of amino acids in the medium but is negatively iron-regulated. Other abiotic factors, such as low oxygen concentration or low pH do not have drastic effects on NABD biosynthesis by the strain. Globally, with regard to specific conditions that the strain undergoes in the rhizosphere environment, it supposes that the nutritional/physiological state of BTP1 cells growing on plant roots is compatible with an effective production of the elicitor.Plant responses induced following root treatment with Bacillus subtilis S499 have also been investigated. Working on whole plants, it first revealed an increase in enzyme activities of the oxylipin pathway (lipoxygenase (LOX) and lipid-hydroperoxydase) after infection. Further investigations were conducted on cultured tobacco cells and we have shown the induction of some early events, such as extracellular pH alkalinization, reactive oxygen species production, defence enzyme stimulation (LOX and phenylalanine ammonia lyase (PAL), and accumulation of some phenolics from the phenylpropanoid pathway. These experimentations performed with Bacillus lipopeptides are the first conducted with ISR-specific elicitors and led to the characterization of early events that can also be triggered by pathogen associated molecules. It is still not clear whether bacterial LPs are recognized by plant cells via specific receptors but the amphiphilic and detergent properties of surfactin strongly suggest that these LPs can interact via a less specific mechanism based on some limited destabilization of the membrane structure.In conclusion, NABD and lipopeptides studied in this thesis enlarge the range of elicitors from non pathogenic bacteria isolated to date, and may be considered as members of a new class of ISR-inducing compounds of amphiphilic nature./Lors du phénomène appelé « résistance systémique induite » (ISR), des rhizobactéries non pathogènes peuvent conférer à la plante un certain degré de protection à des attaques ultérieures par un phytopathogène via la stimulation de mécanismes de défense systémiques. Cette « immunité » s’initie suite à la perception par la plante de molécules dites élicitrices produites par le microorganisme bénéfique. L’objectif de cette thèse est de contribuer à la caractérisation de ce dialogue moléculaire en se basant sur des études antérieures poursuivies au laboratoire qui ont mis en évidence la capacité des souches Pseudomonas putida BTP1 et Bacillus subtilis S499 (aussi dénommée M4) à induire l’ISR chez leur hôte végétal.La première partie des recherches sur BTP1 a permis d’isoler en tant qu’éliciteur un nouveau type de composé produit par les Pseudomonas. Cet éliciteur a été isolé à partir de surnageant de culture de la bactérie et est constitué d’un noyau benzylamine dont l’azote est alkylé par deux groupements méthyle et un groupement tétradécyle, responsables de l’hydrophobicité relative de la molécule. Sur cette base, ce métabolite a été dénommé NABD (N-alkylated benzylamine derivative). Grâce au traitement des plantes avec le composé purifié ou via l’utilisation de mutants altérés dans sa production, nous avons démontré que le NABD était responsable de l’essentiel de l’activité ISR de BTP1 sur le haricot et le concombre. Dans le cas de la tomate par contre, il semble qu’il ne soit pas le seul éliciteur impliqué. En ce qui concerne Bacillus subtilis S499, en utilisant des approches similaires, nous avons pour la première fois montré l’implication de deux lipopeptides, la surfactine et la fengycine, comme agents stimulateurs de l’ISR, permettant ainsi de leur attribuer un nouveau rôle dans le contrôle biologique des maladies des plantes par Bacillus. Une étude de la relation structure/activité a été entamée et a révélé un rôle du noyau aromatique dans l’établissement de la résistance systémique par le NABD. Pour la surfactine, l’importance de la longueur de la chaîne alkylée ainsi que la présence des charges sur les acides aminés suggèrent que son activité élicitrice soit liée à ses propriétés amphiphiles. La détection en quantités significatives des deux types d’éliciteurs dans la rhizosphère des plants traités par les bactéries est également en faveur de leur rôle biologique. Dans le cas de BTP1, nous avons étudié l’influence de certains paramètres physiologiques, nutritionnels et physico-chimiques sur la production du NABD. Les résultats montrent que la production du NABD est dépendante de la présence d’acides aminés dans le milieu, qu’elle est effective à un taux de croissance faible du microorganisme, qu’elle est négativement influencée par le fer mais qu’elle n’est pas inhibée par une restriction en oxygène dissous disponible ou par une acidification du milieu. Globalement, ces données suggèrent que les conditions physico-chimiques dictant l’état physiologique des cellules bactériennes in situ peuvent être propices à une synthèse effective de l’éliciteur au niveau des racines.Des recherches sur les réponses induites chez l’hôte lors de son interaction avec S499 ont été initiées et montrent une nette augmentation d’activités enzymatiques de la voie des oxylipines (activités lipoxygénase (LOX) et lipide hydroperoxydase) dans les feuilles après infection. Une exploration plus approfondie sur suspensions de cellules de tabac en culture avec la surfactine a montré l’induction de plusieurs autres mécanismes précoces de défenses, comme une alcalinisation du milieu extracellulaire, la production d’espèces oxydantes, l’activation d’enzymes de défense telles que LOX et phenylalanine ammonia lyase (PAL), et une possible réorientation de la voie des phénylpropanoïdes. Ces expérimentations menées avec les lipopeptides de Bacillus sont parmi les premières à être réalisées avec des éliciteurs spécifiques de l’ISR. Elles ont abouti à la caractérisation de plusieurs réponses précoces dont certaines sont aussi induites par des molécules isolées d’agents pathogènes. Les lipopeptides pourraient ainsi agir en stressant les cellules de l’hôte via une perturbation temporaire de la membrane externe facilitée par leur propriété amphiphile. L’implication de récepteurs dans la reconnaissance des éliciteurs de BTP1 et S499 ne peut cependant pas être exclue.En conclusion, les lipopeptides et le NABD élargissent la gamme des éliciteurs bactériens de l’ISR isolés jusqu’à présent et peuvent être considérés comme appartenant à une nouvelle classe d’immuno-stimulateurs des plantes comprenant des molécules amphiphiles.
