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Abstract :
[en] Der p 3, an allergen of the house dust mite Dermatophagoides pteronyssinus, is a serine protease of the trypsin-like family. In addition to allergenic properties, its protease activity might be involved in its adjuvant effect in the pathogenesis of allergy. The protease is synthesized as an inactive proDer p 3 zymogen formed by an 11 amino acid N-terminal propeptide and a protease domain of 232 amino acids. No recombinant source of Der p 3 has been described yet and the zymogen maturation mechanism remains to be elucidated. The presence of a Thr implicated in a potential N9AT N-glycosylation site at the C-terminal end of the Der p 3 propeptide suggests, however, a unique activation mechanism. The first part of this study was thus dedicated to express the zymogen in the yeast Pichia pastoris, to investigate its activation mechanism and to characterize the recombinant Der p 3 protease. With the use of both discontinuous and continuous enzymatic tests, we showed that the unusual intermolecular activation mechanism of proDer p 3 is mediated by the house dust mite cysteine protease Der p 1. Glycosylation of the propeptide was found to decrease the rate of maturation. We report for the first time a recombinant source of Der p 3, with the same enzymatic activity as the natural enzyme and trypsin. In the second part of this study, we analyzed the role of the propeptide and its particular polyproline rich motif (PRM) (NP2ILP5ASP8NAT) in the folding, thermal stability and maturation mechanism of the zymogen and also in the inhibition of Der p 3. Using non glycosylated zymogens, with one or all prolines replaced by alanine(s), we showed that, although the entire propeptide is not required to obtain a correctly folded protease, the PRM is important for resistance of proDer p 3 to undesired proteolysis. Amino-terminal deletions introduced in the propeptide did not influence the thermal stability of the protease. With the help of a quench flow system coupled to mass spectrometry, we determined the catalytic parameters (kcat, Km and kcat/Km) characteristic of the Der p 3 zymogen activation by Der p 1 and we demonstrated that prolines, mainly at positions 5 and 8, are crucial for activation. Finally, we showed that Der p 3 is inhibited by the free modified prosequence TP1R and that prolines affect the mode of inhibition of the protease.Two other allergens of the D. pteronyssinus species, termed Der p 6 and Der p 9, are serine proteases with chymotrypsin and elastase specificities, respectively. Similarly toDer p 1 and Der p 3, both are also expressed as inactive zymogen forms and matured into active proteases. These four proteases might be involved in the mite digestion. With the help of FRET synthetic peptides containing the activation sites of the four zymogen forms, we highlighted the proteolytic cascade occurring in the mite and, in particular, we elucidated the activation mechanism of proDer p 6 and proDer p 9./L’allergène de l’acarien Dermatophagoides pteronyssinus Der p 3 est une protéase à sérine active appartenant à la famille de la trypsine. Son activité protéolytique pourrait être un facteur adjuvant impliqué dans le développement et la chronicité de l’allergie. Cette protéase est synthétisée sous forme d’un précurseur inactif, proDer p 3, qui est constitué d’un propeptide 11 acides aminés suivi d’un domaine protéase de 232 acides aminés. A l’heure actuelle, le mécanisme d’activation de ce zymogène n’a pas encore été élucidé et il n’existe aucune forme recombinante de l’allergène Der p 3. La présence d’une thréonine à l’extrémité C-terminale du propeptide ainsi que celle d’un site potentiel de N-glycosylation N9AT suggèrent un mécanisme d’activation particulier. Durant la première partie de cette étude, nous nous sommes intéressés à l’expression recombinante de proDer p 3 en Pichia pastoris, à l’élucidation de son mécanisme d’activation et à la caractérisation de la forme mature Der p 3. Au moyen de tests enzymatiques continus et discontinus, nous avons mis en évidence que le mécanisme d’activation inter-moléculaire de proDer p 3 est médié par la protéase à cystéine active Der p 1. La cinétique d’activation était ralentie par la présence de la glycosylation au niveau du propeptide. Enfin, nous avons obtenu, pour la première fois, une forme recombinante de Der p 3 qui présente les mêmes propriétés enzymatiques que l’allergène naturel et la trypsine.Dans la deuxième partie de cette thèse, nous avons étudié le rôle du propeptide et en particulier celui des prolines du motif riche en prolines (PRM) (NP2ILP5ASP8NAT) dans le repliement, la stabilité thermique, le mécanisme d’activation ainsi que dans l’inhibition de la protéase Der p 3. Au moyen des zymogènes au sein desquels une ou les trois proline(s) a (ont) été remplacée(s) en alanine(s), nous avons pu mettre en évidence que bien que le propeptide en entier ne soit pas nécessaire à l’obtention de zymogènes correctement repliés, ce PRM est important pour la résistance de proDer p 3 à la protéolyse non spécifique. Les délétions amino-terminales introduites dans le propeptide de proDer p 3 n’ont pas modifié la stabilité thermique du zymogène. Au moyen d’un système couplant un système de quench-flow à un spectromètre de masse, nous avons pu déterminer les paramètres catalytiques (kcat, Km et kcat/Km) du mécanisme d’activation du zymogène proDer p 3 par Der p 1 et montrer ainsi que les prolines 5 et 8 du propeptide sont cruciales pour le mécanisme d’activation du pro-enzyme. Finalement, nous avons mis en évidence que Der p 3 est inhibée par la proséquence modifiée TP1R et que les prolines ont un rôle à jouer dans le modèle d’inhibition de la protéase.Deux autres allergènes appartenant à l’espèce D. pteronyssinus sont des protéases à sérine active de type chymotrypsine et élastase et sont nommées respectivement Der p 6 et Der p 9. Comme Der p 1 et Der p 3, ces allergènes sont synthétisés sous forme de précurseurs inactifs et doivent être ensuite activés en protéases matures. Ces quatre groupes d’allergènes seraient impliqués dans la digestion de l’acarien. Au moyen de peptides synthétiques basés sur la stratégie FRET et contenant les sites d’activation des quatre zymogènes, nous avons pu mettre en évidence la cascade protéolytique se déroulant chez l’acarien et plus particulièrement, nous avons élucidé le mécanisme d’activation des zymogènes proDer p 6 et proDer p 9.
