[en] H2O2, a reactive oxygen species (ROS), is known for causing oxidative damage during stress. However, it is now recognized as a signaling molecule, particularly in modifying protein cysteine residues, leading to cysteine sulfenylation in specific proteins. Cellular signaling can be anterograde, driven by the nucleus to other organelles such us chloroplast or mitochondria in the photosynthetic organisms, or retrograde, directed backwards from the organelles to the nucleus. Organisms that undergo photosynthesis, such as cyanobacteria, algae, and plants, primarily produce H2O2 in the chloroplasts during photosynthesis and in the mitochondria during respiration. In this study, we used the green alga Chlamydomonas reinhardtii. Specifically, our attention was directed towards the H2O2-scavenging enzyme ascorbate peroxidase 2 (APX2), recently classified as ascorbate peroxidase–related (APX-R), of which the function remains unclear. We investigated the cellular role of APX2 and we identified modified cysteines in their sulfenylated form (-SOH) in Chlamydomonas under oxidative stress. With an explorative screening of mutants through molecular and genetic methods, employing 1H-NMR, activity assays, and biophysical techniques with recombinantly expressed and purified APX2 and plastocyanin proteins, and utilizing structure predictions, we discovered that APX2 is most probably localized in the lumen of the chloroplasts and has an impact on plastocyanin. APX2, distinct from typical H2O2 scavengers, also exhibited next to peroxidase activity copper binding in a typical metal binding MxxM sequence motif and is involved in regulating the cellular plastocyanin levels. Through the refinement of a mass spectrometric sulfenome analysis technique applied to protein extracts from Chlamydomonas wild type with and without oxidative stress, we successfully pinpointed one sulfenylated peptide associated with three light-harvesting complexes of photosystem II and one sulfenylated peptide associated with the ATP/ADP carrier protein AAA1. This discovery serves as an initial indication that the regulation of these complexes and of the AAA1 carrier protein involves the modification of a cysteine residue. All in all, our findings reveal a novel function for APX2 and offer insights into sulfenylation patterns in Chlamydomonas. [fr] Le peroxyde d’hydrogène (H2O2) est une espèce réactive de l’oxygène qui cause des dommages liés au stress oxydatif. Cette molécule est aussi impliquée dans les voies de signalisation car elle modifie les résidus cystéine de certaines protéines, en les sulfénylant. Les organismes photosynthétiques comme les cyanobactéries, les algues et les plantes produisent de l’H2O2 dans les chloroplastes lors de la photosynthèse et dans les mitochondries lors de la respiration. Dans notre étude, nous avons utilisé la microalgue verte modèle Chlamydomonas reinhardtii. Nous avons d’une part analysé le rôle d’une ascorbate peroxydase de type R (‘ascorbate-related protein’), APX2, et d’autre part identifié des protéines présentant des résidus cystéine sulfénylés. Concernant APX2, nous avons démontré que la protéine est chloroplastique et probablement adressée dans le lumen des thylacoïdes. Des mutants apx2 déficients pour la protéine montrent un niveau réduit de plastocyanine, la protéine à cuivre majeure au sein du lumen des chloroplastes. Nous avons purifié la protéine recombinante à partir de E. coli. Nous avons démontré qu’elle n’utilise pas l’ascorbate pour réduire le H2O2 en H2O, ce qui valide son appartenance à la classe R des ascorbate peroxydases. De plus, cette enzyme lie le cuivre probablement grâce à la présence d’un motif de liaison aux métaux (MxxM). Nous avons également analysé l’interaction entre la plastocyanine et APX2 en utilisant des approches de 1H-NMR et proposé que APX2 occuperait un site proche de celui de l’insertion du cuivre au sein de la plastocyanine. Nous avons établi un protocole de détection des peptides sulfénylés pour Chlamydomonas et avons identifié quelques protéines répondant au stress H2O2 par la sulfénylation de résidus cystéine (protéines LHCII du système collecteur d’énergie du photosystème II et de l’ADP/ATP translocase chloroplastique). En résumé, notre travail a révélé une nouvelle fonction pour la protéine APX2 de Chlamydomonas et apporté les premiers résultats concernant l’établissement du sulfénome de l’algue. [nl] H2O2, een reactieve zuurstofsoort (ROS), staat erom bekend oxidatieve schade te veroorzaken bij stress, maar wordt nu ook erkend als signaalmolecuul voor het modificeren van cysteïnes in eiwitten, ook gekend als cysteïne-sulfenylatie. Cellulaire signaaloverdracht kan anterograad plaatsvinden, een signaal wordt dan door de kern naar andere organellen gestuurd zoals de chloroplasten of mitochondriën in fotosynthetische organismen, of retrograad, een signaal van de organellen gaat terug naar de kern. Organismen die aan fotosynthese doen, zoals cyanobacteriën, algen en planten, produceren H2O2 voornamelijk in de chloroplasten tijdens de fotosynthese en in de mitochondriën tijdens de ademhaling.
In deze studie gebruikten we de groene alg Chlamydomonas reinhardtii. Onze aandacht ging specifiek uit naar het H2O2-afbrekende enzym ascorbaatperoxidase 2 (APX2), dat onlangs werd geclassificeerd als ‘ascorbate peroxidase–related’ (APX-R) en waarvan de functie nog onduidelijk is. Wij onderzochten de cellulaire rol van het H2O2-afbrekende enzym APX2 en identificeerden gemodificeerde cysteïnen in hun gesulfenyleerde vorm (-SOH) in Chlamydomonas gedurende oxidatieve stress. Met een exploratieve screening van mutanten door middel van moleculaire en genetische methoden, gebruikmakend van 1H-NMR, activiteitstests en biofysische technieken met recombinant geëxpresseerde en gezuiverde APX2 en plastocyanine eiwitten, en door middel van structuurvoorspellingen, ontdekten we dat APX2 zich hoogstwaarschijnlijk in het lumen van de chloroplasten bevindt en een invloed heeft op plastocyanine. Anders dan de typische H2O2-afbrekende enzymen, vertoonde APX2 naast peroxidase activiteit ook koperbinding in een typisch metaalbindend MxxM sequentiemotief en is APX2 betrokken bij het reguleren van de cellulaire plastocyanine niveaus. Door een verfijning van een massaspectrometrische sulfenoom-analysetechniek, toegepast op eiwitextracten van Chlamydomonas wild-type onder zowel normale als oxidatieve stressomstandigheden, hebben we een gesulfenyleerd peptide geïdentificeerd dat geassocieerd is met drie ‘light-harvesting’ complexen van fotosysteem-II en met het ATP/ADP AAA1 dragereiwit. Deze ontdekking dient als een eerste aanwijzing dat de modificatie van een cysteïne betrokken is bij de regulatie van deze complexen en het AAA1 dragereiwit.
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Onze resultaten onthullen een nieuwe functie voor APX2 en geven ons een inzicht in de sulfenyleringspatronen in Chlamydomonas.
Disciplines :
Biochemistry, biophysics & molecular biology
Author, co-author :
Caccamo, Anna ; Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS)
Language :
English
Title :
The role of ascorbate peroxidase 2 and protein cysteine modifications in the green alga Chlamydomonas reinhardtii
Defense date :
25 January 2024
ISBN/EAN :
9789464948073
Number of pages :
279
Institution :
ULiège - University of Liège [Sciences], Liège, Belgium
Degree :
degree of Doctor of Science and Doctor of Bioengineering Sciences
Cotutelle degree :
joint PhD program with the VUB
Promotor :
Remacle, Claire ; Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie > Génétique et physiologie des microalgues ; Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie > Care "PhytoSYSTEMS" ; Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS)
Messens Joris; VIB-VUB Center for Structural Biology, 1050 Brussels, Belgium ; Brussels Center for Redox Biology, 1050 Brussels, Belgium ; Structural Biology Brussels, Vrije Universiteit Brussel, 1050 Brussels, Belgium
President :
Hanikenne, Marc ; Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS) ; Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie > Biologie végétale translationnelle
Secretary :
Angenon, Geert; Department of Bioengineering Sciences, Plant Genetics Laboratory, Vrije Universiteit Brussel
Jury member :
Kerff, Frédéric ; Université de Liège - ULiège > Département des sciences de la vie > Centre d'Ingénierie des Protéines (CIP) ; Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS) ; Université de Liège - ULiège > Département de chimie (sciences)
Ruytinx, Joske; Department of Bioengineering, Sciences Microbiology research group, Vrije Universiteit Brussel
Vertommen, Didier; de Duve Institute, Université Catholique de Louvain
Hippler, Michael; WWU Münster, Institute of Plant Biotechnology and Biology Plant Biochemistry and Biotechnology, Universität Münster
F.R.S.-FNRS - Fonds de la Recherche Scientifique [BE] FWO - Fonds Wetenschappelijk Onderzoek Vlaanderen [BE] EOS - The Excellence Of Science Program [BE]
The goal was to see different gene expression in a wild-type and a mutant of APX2 protein in Chlamydomonas reinhardtii in copper-replete and copper-deficient conditions
The goal was to see difference in protein abundance in a wild-type and a mutant of APX2 protein in Chlamydomonas reinhardtii in copper-replete and copper-deficient conditions
