Construction et caractérisation d'hydrolases du peptidoglycane avec de nouvelles propriétés antibactériennes

La résistance aux antibiotiques est aujourd’hui une problématique majeure de santé publique. En 2014, un rapport très alarmant a été publié par l’économiste Jim O’Neill. Ce rapport prédit qu’en 2050, la mortalité annuelle due à l’antibiorésistance sera supérieure à la mortalité annuelle due au cancer actuellement (plus de 10 millions). Ces chiffres alarmants soulignent la nécessité de relancer la recherche afin de mettre au point de nouveaux moyens pour combattre l’antibiorésistance. Différentes pistes ont été explorées ces dernières années (phages, enzymes, peptides…). La piste enzymatique se révèle particulièrement intéressante. Elle permet de tirer parti de l’efficacité de la machinerie enzymatique des bactériophages tout en évitant le risque de mutations in vivo de ces derniers. Ce travail de fin d’études a été réalisé au centre d’ingénierie des protéines de Liège, dans le laboratoire « paroi et division cellulaire » sous la supervision du docteur Mohammed Terrak. Le but est d’étudier l’effet de la complexation d’un domaine de liaison au PG (binding) à un domaine catalytique. En théorie, cette complexation permettrait d’augmenter l’activité du domaine catalytique et pourrait même lui conférer une certaine spécificité. Pour y parvenir, de créer des protéines chimères constituées de 2 domaines sont produites. Trois domaines de binding sont analysés : le domaine AMIN de l’amidase C, le domaine SPOR de la protéine FtsN et le domaine SH3b de la lysostaphine. Un seul domaine catalytique est analysé : le lysozyme du phage lambda. Ce travail est scindé en deux objectifs :

1) Expression et purification : des bactéries compétentes (E. coli BL21) sont transformées avec les plasmides contenant les séquences codant pour la protéine d’intérêt. Chacun des domaines est produit avec une queue poly-histidine qui permettra la purification sur colonne d’affinité ainsi qu’un peptide coiled-coil SYNZIP (SZ). Ce dernier permet à Cell Wall Binding Domain (possédant un SZ2) de former un complexe avec le lysozyme (possédant un SZ1).

2) Caractérisation : avant de procéder aux tests d’activité des protéines produites, il faut s’assurer que les complexes CBD - Lysozyme se sont bien formés. Pour ce faire, une analyse par chromatographie d’exclusion stérique combinée à un détecteur de type multi-angle light scattering (MALS) est réalisée. Trois tests d’activités sont effectués pour chacun des CBD, seul ou complexé au lysozyme. Le premier est un Turbidity Reduction Assay, le second un Growth Inhibition Assay et le dernier un test d’hydrolyse sur PG marqué au Remazol Brilliant Blue.