Abstract :
[fr] Objectif : Les anticoagulants oraux directs (DOACs) – apixaban, dabigatran et rivaroxaban - sont de plus en plus utilisés comme alternative aux antagonistes de la vitamine K classiques (acénocoumarol et warfarine). Ils ont pour avantage de ne pas nécessiter une surveillance biologique régulière puisqu’ils ont une dose–réponse prédictible et peu d’interactions médicamenteuses et alimentaires. Cependant, en cas d’hémorragie ou d’acte chirurgical à réaliser en urgence, il est utile de pouvoir les doser de manière spécifique afin d’adapter le traitement du patient (1). Afin de répondre à ce besoin, une méthode de dosage simultané de l’apixaban, du dabigatran et du rivaroxaban dans le sérum par chromatographie en phase liquide à ultra haute pression couplée à un spectromètre de masse en tandem (UHPLC/MSMS) a été mise au point et validée dans notre laboratoire.
Méthode : Après l’ajout de 3 standards internes deutérés (apixaban-13C-D3, dabigatran-d3 et rivaroxaban-d4), l’échantillon de sérum (100µl) subit une précipitation par 400 µl d’acide formique à 1% dans du méthanol. 10µl de surnageant sont ensuite injectés en UPLC/MSMS. La séparation chromatographique se fait sur une colonne Acquity HSS T3 (2.1*100mm, 1.8µm, Waters). La phase mobile est délivrée selon un mode gradient, elle se compose d’un tampon formiate d’ammonium 5mM pH3 et d’acide formique à 0.1% dans du méthanol. Les composés sont ensuite analysés par spectrométrie de masse tandem en mode MRM. Deux transitions sont enregistrées par molécule. L’analyse de six standards de calibration en double pendant 3 jours a permis d’établir la fonction de réponse la mieux adaptée et la réalisation de 5 standards de validation en triple pendant 3 jours a permis de calculer les limites de la méthode analytique (justesse, précision, limites de détection et de quantification, linéarité, incertitude de mesure et exactitude).
Résultats : Les 3 composés sont séparés en 10 minutes. La méthode est linéaire jusque 385 ng/mL, 302 ng/ml et 297 ng/ml respectivement pour apixaban, dabigatran et rivaroxaban. Les biais et les coefficients de variation (répétabilité et précision intermédiaire) sont inférieurs à 15% dans l’intervalle de dosage. Les limites supérieures et inférieures de l’intervalle de tolérance sont comprises dans les limites d’acceptation de 30% pour les concentrations supérieures à 50ng/ml et de 40% pour les concentrations inférieures à 50 ng/ml. Les LOQ sont respectivement de 27.9 ng/ml, 22.5 ng/ml et 21.6 ng/ml pour apixaban, dabigatran et rivaroxaban.
Conclusions : La méthode de dosage des DOACs dans le sérum est validée avec succès et répond parfaitement aux critères imposés par l’European Medicines Agency. La préparation des échantillons est très simple, la séparation chromatographique est rapide, la spécificité de l’analyse est garantie par l’étude de deux transitions par molécule.
Référence :
1. N. Gendron, D. Smadja, Les anticoagulants oraux directs : quelle est la place de la biologie dans leur suivi et/ou leur utilisation ?, Ann Biol Clin 2015 ; 73 (supplément 1) : 26-28
