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Dissertations and theses : Doctoral thesis
Life sciences : Biochemistry, biophysics & molecular biology
http://hdl.handle.net/2268/156419
Caractérisation structurale des protéines et de complexes non covalents par "footprinting" et MALDI In-Source Decay
French
Lemaire, Pascale mailto [Université de Liège - ULiège > > > Doct. sc. (bioch., biol. mol.&cell., bioinf.&mod.-Bologne)]
27-Aug-2013
Université de Liège, ​Liège, ​​Belgique
Docteur en Sciences
De Pauw, Edwin mailto
[fr] Conformation ; Interaction ; Accessibilité au solvant
[fr] La fragmentation de protéines entières dans la source d’un spectromètre de masse
(« In-Source Decay » ou « ISD ») lors de l’ionisation-désorption laser assistée
par une matrice (« Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionisation » ou « MALDI »)
permet leur identification. On parle alors de méthode « Top-down », par
opposition à l’approche « Bottom-up » dans laquelle les protéines sont d’abord
digérées en peptides. Cette fragmentation étant rapide, elle peut être considérée
comme une technique intéressante pour analyser les régions d’une protéine qui
sont accessibles au solvant dans des expériences qualifiées de « footprinting ».
En effet, les zones non accessibles soit en raison de la conformation d’une
protéine soit suite à son interaction avec un ligand seront protégées. En plus
d’être rapide, la fragmentation par MALDI-ISD ne nécessite qu’une faible
quantité d’échantillon. Les spectres de masse obtenus sont principalement
composés d’ions fragments monochargés résultant de la rupture de la liaison
peptidique, ce qui permet leur interprétation en termes de séquence. Cette
technique peut donc être intégrée dans une stratégie permettant d’obtenir
rapidement des données qualitatives concernant la topologie d’une protéine.
Dans ce manuscrit, la fragmentation par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser
les sites qui sont accessibles au solvant et par là, les sites protégés par repliement
ou par interaction de protéines avec des ligands non covalents. Les méthodes de
footprinting qui utilisent des techniques de marquage oxydatif ou de marquage
par le deutérium en solution ont été utilisées. La fragmentation ISD elle même
peut être vue comme une méthode de footprinting directe, n’utilisant pas de
marquage préalable de protéines en solution. Cette analyse repose sur l’étude des
modifications d’accessibilité des groupes carbonyles en comparant le profil de
fragmentation des protéines lors d’un changement structural ou lors de leur
interaction avec un ligand.
Footprinting oxydatif analysé par MALDI-In-Source Decay. N’ayant jamais été
exploitée pour l’analyse des données de footprinting oxydatif, la fragmentation
par MALDI-ISD a été utilisée pour localiser les sites d’oxydation du peptide
amyloïde Aβ(1-40). Une étude de la faisabilité de détection de produits d’oxydation
ainsi que l’identification des chaînes latérales oxydées a tout d’abord été
effectuée en oxydant le peptide Aβ(1-40) dans une solution de peroxyde
d’hydrogène. La modification des profils de fragmentation ISD du peptide oxydéa été expliquée par la probabilité d’intervention de compétitions de réactions
d’addition radicalaire et de transfert de charge. Cet effet sur l’aspect global des
spectres de masse n’affecte cependant que le rendement des oxydations et non
leur localisation. L’oxydation du peptide Aβ(1-40) résultant de son interaction
spécifique avec le fer a permis de valider l’utilisation de la méthode pour la
localisation des sites d’oxydation. Une corrélation entre l’identité des résidus
oxydés et les données d’interaction du métal fournies par la littérature a pu être
établie. Le peptide Aβ(1-40) constitue une cible thérapeutique potentielle étant
donné son implication dans la toxicité cellulaire observée dans la maladie
d’Alzheimer. Les sites d’interaction de molécules bi-aromatiques susceptibles
d’inhiber potentiellement l’agrégation du peptide devaient au départ être
identifiés par la méthode d’échange hydrogène/deutérium (« hydrogen/deuterium
exchange » ou « HDX ») analysé par MALDI-ISD. Les premières expériences
ont cependant révélé que les fonctions amides du peptide étaient caractérisées par
des cinétiques d’échange isotopique intrinsèques rapides. Le marquage oxydatif
par des radicaux hydroxyles produits par photolyse laser du peroxyde
d’hydrogène a été la stratégie alternative de choix pour l’étude d’interaction du
peptide avec un ligand bi-aromatique leader. Une diminution de la proportion de
la forme mono-oxydée du peptide en présence du ligand est observée sur les
spectres de masse MALDI. L’identité de l’acide aminé oxydé n’a
malheureusement pas été élucidée, cependant, la méthionine 35 pourrait être
l’acide aminé oxydé.
Footprinting utilisant le deutérium analysé par MALDI-In-Source Decay. La
matrice MALDI 1,5-DAN qui est pourtant connue pour présenter un potentiel
réducteur élevé, favorisant la production d’ions fragments par MALDI-ISD, n’a
cependant jamais été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de
protéines. Les cinétiques d’échange H/D intrinsèques rapides du peptide Aβ(1-40)
ont permis de l’utiliser comme modèle pour évaluer l’utilisation de la matrice
1,5-DAN pour le couplage de l’échange H/D à la spectrométrie de masse
MALDI. L’homogénéité des profils d’échange isotopique et le degré de rétroéchange
moyen observé sur un spot MALDI ont été examinés en comparant les
résultats obtenus avec la matrice 1,5-DAN à ceux obtenus avec trois matrices
MALDI plus communes. Les résultats révèlent qu’outre son potentiel réducteur
élevé, la matrice 1,5-DAN possède une cinétique de cristallisation très rapide. Ceparamètre facilite la mise au point de protocoles robustes. La matrice 1,5-DAN a
été utilisée pour l’analyse des données d’échange H/D de la structure tertiaire de
l’ubiquitine dans des conditions natives. Les résultats obtenus en ISD sont en
accord avec des données préalablement obtenues en ETD et RMN. Cet accord
entre les résultats a permis de valider la méthode proposée. Une seconde étude
basée sur la caractérisation de structures secondaires a été effectuée avec la β-
endorphine. Les profils d’échange H/D de la β-endorphine sous une structure
secondaire hélicoïdale, induite par le méthanol, ont été comparés à ceux obtenus
lorsque le peptide est sous une conformation en pelote statistique non périodique.
Le peptide sous sa conformation hélicoïdale présente systématiquement une
accessibilité au solvant plus réduite. Les résultats obtenus sont en accord avec les
prédictions qualitatives, sur base de la polarité des acides aminés, de formation
d’hélices α induite par le méthanol.
Footprinting utilisant la voie de fragmentation radicalaire en MALDI-In-
Source Decay. Les résultats de marquage oxydatif du peptide Aβ(1-40) analysé par
MALDI-ISD ont révélé une variation considérable de l’intensité relative de
signaux ioniques caractéristiques d’une fragmentation induite par les radicaux
hydrogènes de la matrice. Le profil de fragmentation est modifié au niveau de
l’ion fragment caractérisant la tyrosine 10 du peptide. Ce résidu, selon la
littérature, est impliqué dans l’interaction du peptide avec le fer. Nous avons
donc évalué l’utilisation de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting
reposant sur l’étude de l’accessibilité des groupes carbonyles des protéines aux
radicaux hydrogènes de matrice. Une comparaison des spectres de fragmentation
ISD du lysozyme humain natif ou dénaturé puis alkylé en solution a été réalisée.
Les profils de fragmentation ISD des deux conformères du lysozyme sont
différents. En particulier, les ions fragments c18, c19 et z14 ont fourni une
information pertinente sur la différence d’accessibilité des deux conformères visà-
vis des radicaux hydrogènes. Cependant, la différence d’intensité de l’ion
fragment z14 observée entre les deux conformères peut aussi être expliquée par un
effet de l’alkylation de la cystéine 116 du lysozyme sur le clivage du lien N—Cα
du côté C-terminal du résidu. Une étude supplémentaire a été réalisée avec un
complexe formé entre le lysozyme humain et un fragment d’anticorps de
camélidé, cAb-HuL6. L’objectif était de détecter une modification éventuelle du
profil de fragmentation ISD lors de la complexation du lysozyme. Les intensitésrelatives des ions fragments caractérisant des acides aminés de l’interface du
complexe lysozyme—cAb-HuL6 sont peu modifiées par rapport à celles du
complexe Aβ(1-40)—Fe. Cette observation a conduit la conclusion que l’utilisation
de la fragmentation ISD comme méthode de footprinting dépend non seulement
de la stabilité du complexe (constante d’affinité, Kaff, et constante de vitesse de
dissociation, kd) et des conditions expérimentales utilisées (solvant, additifs et
matrice), mais aussi du type d’interactions impliquées dans la formation du
complexe.
Laboratoire de spectrométrie de masse
AHAF et FRIA
Researchers
http://hdl.handle.net/2268/156419

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