STUDIO in vitro DEI PARAMETRI DI COINFEZIONE E SUPERINFEZIONE CHE INFLUENZANO LA RICOMBINAZIONE NEI NOROVIRUS

I norovirus (NoV) sono piccoli virus (38-40 nm) a RNA monocatenario sprovvisti di envelope appartenenti alla famiglia Caliciviridae. I NoV attualmente vengono riconosciuti come una delle più importanti cause di gastroenterite acute di origine non batterica nell'uomo coinvolgendo tutte le classi di età e soprattutto contesti comunitari. I meccanismi molecolari che influenzano l'evoluzione dei NoV sono l'accumulo di mutazioni puntiformi e la ricombinazione. L’obiettivo sarà quello di dimostrare che la ricombinazione è un evento che può essere influenzabile dall’impiego di diversi parametri di coinfezione/superinfezione. In letteratura, gli studi sugli eventi ricombinanti che caratterizzano i NoV umani risultano piuttosto limitati a causa dell'assenza di un substrato cellulare che ne permetta la replicazione in vitro. Nel presente lavoro è stato sviluppato un modello sperimentale basato sull’impiego dell’unico NoV, il norovirus murino (MNV), in grado di replicare su substrato cellulare. A tal fine monostrati di cellule RAW264.7 sono stati coinfettati e superinfettati con due ceppi di MNV (CW1 e WU20) utilizzando diversi indici di molteplicità (MOI) e differenti tempi di infezione. I surnatanti sono stati collezionati a 24 e 48 ore post-infezione e quindi sottoposti a metodo delle placche. All’interno della popolazione virale risultante da tale coinfezione/superinfezione, 36 cloni per ciascuna condizione sono stati selezionati e purificati dalle placche e, successivamente, utilizzati per infettare nuovi monostrati cellulari di RAW264.7. Il monitoraggio degli eventi ricombinanti è stato eseguito mediante PCR e Real-Time PCR dopo estrazione dell'RNA virale e retrotrascrizione, impiegando due set di primer in grado di amplificare le regioni site all’estremità iniziale di ORF1 e all’estremità terminale di ORF3. I risultati che permetteranno di quantificare la distribuzione dei ceppi presenti nel surnatante della superinfezione, sono ancora in corso di analisi.