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Doctoral thesis (Dissertations and theses)
Etude des propriétés des variants amyloïdogéniques du lysozyme humain à l’aide de fragments d’anticorps à chaînes lourdes comme sondes structurales
Dumont, Janice
2014
 

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Keywords :
Lysozyme humain; fragment d'anticorps de camélidés; fibres amyloïdes
Abstract :
[fr] Les fibres amyloïdes sont des agrégats de protéines hautement organisés qui sont associés à une trentaine de maladies appelées amyloses, dont les maladies d'Alzheimer et de Parkinson et la maladie de la vache folle. L'amylose systémique à lysozyme est une amylose non-neuropathique héréditaire associée à sept variants de la protéine (Y54N, I56T, F57I, W64R, D67H, F57I/T70N et W112R/T70N). Ces protéines forment des fibres amyloïdes extracellulaires qui se déposent dans de nombreux tissus et organes tels que le foie, la rate et les reins. Il a été montré que les mutations I56T et D67H diminuent la stabilité et la coopérativité globale de la protéine. Ainsi, dans des conditions proches des conditions physiologiques, ces variants forment, in vitro, transitoirement un état intermédiaire dans lequel le domaine β et l'hélice C se déplient de manière coopérative, alors que le reste du domaine α conserve sa structure native. La formation d'interactions intermoléculaires entre les régions dépliées serait à l'origine du processus d'agrégation qui conduit à la formation et au dépôt de fibres amyloïdes dans les tissus des patients porteurs de ces mutations. Il a également été montré que la liaison de trois fragments d'anticorps à chaînes lourdes de camélidés (VHH), dirigés contre le lysozyme humain de sauvage, inhibe in vitro la formation de fibres amyloïdes par les variants D67H et I56T. Ces trois VHH se lient à des régions différentes du lysozyme et inhibent la formation de fibres amyloïdes selon différents mécanismes. Au cours de ce doctorat, seize nouveaux VHH spécifiques du lysozyme humain ont été générés. Des expériences de liaisons compétitives suivies par résonnance plasmonique de surface ont montré que les 16 VHH se lient à cinq épitopes distincts à la surface du lysozyme. Quatre d’entre eux sont capables de se lier au lysozyme dans les conditions utilisées in vitro pour induire la formation de fibres amyloïdes par les variants du lysozyme. Leur site de liaison a été déterminé par RMN. Deux d'entre eux reconnaissent des épitopes différents de ceux des trois VHH caractérisés précédemment. Des expériences d’échange H/D analysés par spectrométrie de masse ont montré que les 4 VHH ont des capacités différentes à restaurer la coopérativité globale du variant D67H du lysozyme. L’analyse de l’ensemble des résultats nous a permis d’identifier qu'elles sont les régions du lysozyme qui doivent être affectées par la liaison d'un VHH afin de restaurer la coopérativité globale de la protéine. La liaison simultanée aux deux domaines (i.e. α et β) semble être le dénominateur commun de tous les VHH restaurant la coopérativité globale du variant D67H. La liaison aux hélices B et C, ainsi que de l'interface des deux domaines semble aussi contribuer à la restauration de la coopérativité globale. A l'inverse, une liaison qui perturbe la partie N-terminale ne permet pas de restaurer la coopérativité globale de la protéine. La liaison d’un VHH, cAb-HuL9a, au variant D67H du lysozyme inhibe de manière similaire la formation de l’intermédiaire partiellement déplié, l'élongation de fibres amyloïdes préformées et la formation de fibres amyloïdes in vitro. Cette observation est en accord avec l’hypothèse selon laquelle, la formation de cet intermédiaire est à l’origine de l’amyloïdogénicité des variants du lysozyme. Afin d'étudier les effets des mutations amyloïdogéniques récemment identifiées sur les propriétés du lysozyme et ainsi obtenir une meilleure connaissance du mécanisme de formation des fibres amyloïdes, il est nécessaire de produire ces variants en grande quantité. Les variants D67H, I56T et F57I sont produits dans Aspergillus niger. L'expression des variants dans ce micro-organisme est toutefois particulièrement chronophage alors que les rendements de production sont relativement faibles. Les tentatives d'utiliser d'autres systèmes de production tels que Pichia pastoris ou le système bacculovirus n'ont pas été concluantes. Aussi, dans le cadre de mon doctorat, j’ai étudié la possibilité de produire le variant D67H sous forme de corps d'inclusion dans Escherichia. coli. Un protocole permettant de produire 20 mg de protéine sous forme de corps d’inclusion par litre de culture a été développé. Différents stratégies ont été testées pour replier la protéine à partir des corps d’inclusion. Cette approche a permis d’obtenir une protéine ayant 90% d’activité spécifique du lysozyme. Le rendement massique obtenu après repliement est néanmoins très faible.
Research center :
CIP - Centre d'Ingénierie des Protéines - ULiège
Disciplines :
Biotechnology
Author, co-author :
Dumont, Janice ;  Université de Liège - ULiège > Doct. sc. (bioch., biol. mol.&cell., bioinf.&mod.-Bologne)
Language :
French
Title :
Etude des propriétés des variants amyloïdogéniques du lysozyme humain à l’aide de fragments d’anticorps à chaînes lourdes comme sondes structurales
Alternative titles :
[en] Study of amyloidogenic properties of human lysozyme variants with heavy chain antibody fragments as structural probes
Defense date :
30 April 2014
Number of pages :
147
Institution :
ULiège - Université de Liège
Degree :
Docteur en sciences
Promotor :
Dumoulin, Mireille  ;  Université de Liège - ULiège > Integrative Biological Sciences (InBioS)
Name of the research project :
Étude des propriétés des variants amyloïdogéniques du lysozyme humain à l'aide de fragments d’anticorps à chaînes lourdes comme sondes structurales
Funders :
F.R.S.-FNRS - Fonds de la Recherche Scientifique [BE]
Available on ORBi :
since 01 May 2014

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