COMMUNAUTÉ FRANÇAISE DE BELGIQUE
ACADEMIE UNIVERSITAIRE WALLONIE-EUROPE
UNIVERSITE DE LIEGE-GEMBLOUX AGRO-BIO TECH

CONTRIBUTION A L’ETUDE DE LA RESISTANCE AU SECHAGE DE PSEUDOMONAS FLUORESCENS

MPUTU KANYINDA Jean-Noël

Dissertation originale 
présentée en vue de l’obtention du grade de 
docteur en sciences agronomiques et ingénierie biologique

Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Présidente

Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Promoteur  
Unikin/ RDCongo             Promoteur
Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Co-promoteur
Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Membre
Ulb			          Membre
CRA-W		          Membre
Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Membre
Ulg-Gbx Agro-Bio Tech   Membre

Membres du jury :

Professeur Marianne SINDIC

Professeur Philippe TONART
Professeur Philippe NOKI
Docteur Jacqueline DESTAIN
Professeur Frank DELVIGNE  
Professeur Jean-Michel KAUFFMANN
Docteur Jean-Michel ROMNEE 
Professeur Micheline VANDENBOL
Docteur Sabine DANTHINE

                                                      -2013-

Copyright. Aux termes de la loi belge du 30 juin 1994, sur le droit d’auteur et les droits voisins, seul l’auteur a le droit de reproduire partiellement ou complètement cet ouvrage de quelque façon et forme que ce soit ou d’en autoriser la reproduction partielle ou complète de quelque manière et quelque forme que ce soit. Toute photocopie ou reproduction sous autre forme est donc faite en violation de la dite loi et des modifications ultérieures.
MPUTU KANYINDA Jean-Noël (2013). Contribution à l’étude de la résistance au séchage de Pseudomonas fluorescens. Université de Liège, Gembloux Agro-Bio Tech. 149 pages, 8 tableaux, 24 figures.
Résumé: L’objectif de cette thèse est d’étudier la résistance au séchage de Pseudomonas fluorescens. La lyophilisation est la méthode la plus adaptée au séchage de P. fluorescens. Cependant, la lyophilisation induit une perte de viabilité des cellules. Cette perte de viabilité est principalement liée à la rupture membranaire, à la température et à l’oxydation des acides gras, des protéines membranaires et du glutathion. A cet effet, l’utilisation  de composés protecteurs pendant la lyophilisation a permis l’obtention d’une poudre possédant une viabilité élevée. Nous avons ensuite étudié l’impact de ces composés protecteurs, de l’oxygène et de la température de conservation sur la viabilité de P. fluorescens au cours du stockage. Les analyses des acides gras, des protéines, du glutathion et l’étude de l’intégrité membranaire au cours des différents procédés de fabrication et de stockage ont permis d’établir un lien entre le degré d’oxydation et la mortalité cellulaire. Les résultats de la cytométrie en flux ont montré que la lyophilisation affecte plus  la viabilité de P. fluorescens plutôt que le stockage. Nous avons augmenté le rendement de la production en fermenteur de P. fluorescens en réduisant de moitié son temps de culture.

MPUTU KANYINDA Jean-Noël (2013). Contribution to the study of the resistance to drying of Pseudomonas fluorescens. University of Liege, Gembloux Agro-Bio Tech. 149 pages, 8 tables, 24 figures.
Abstract: The objective of this thesis is to study the resistance to drying of Pseudomonas fluorescens. Freeze-drying is the most suitable method for drying P. fluorescens. However, freeze-drying induced loss of cell viability. This loss of viability is mainly due to membrane rupture, temperature and oxidation of fatty acids, membrane proteins and glutathione. For this purpose, the use of protective compounds during freeze-drying has allowed us to obtain a powder having a high viability. We then studied the impact of these protective compounds, oxygen and storage temperature on the viability of P. fluorescens during storage. Analyses of fatty acids, proteins, glutathione and the study of membrane integrity during the various manufacturing processes and storage have established a link between the degree of oxidation and cell death. The results of flow cytometry showed that the freeze-drying longer affects the viability of P. fluorescens rather than storage. We have increased the yield of the production in bioreactor of P. fluorescens and time of culture was halved.

Dédicace

A mes grands parents
A mes nièces et neveux 
A mon épouse Mamy CIMONA NTUMBA
A Chris MPUTU, Erika MUADI et Gertrude MPUTU
A ma grande sœur chérie Christina MPUTU TSHIBADI
A mes parents Ir MPUTU KENA-KUDIA Bismark et KALUBI KAYEMBE Christine 
A mes frères Eddy MPUTU, Serge MPUTU, Giresse MPUTU, Timothée MPUTU, Omega et Clément MPUTU. 

Remerciements
Au terme de ce travail de thèse, il m’est agréable d’adresser mes sincères remerciements à tous ceux qui, de près ou de loin, m’ont apporté aide et conseils pour sa réalisation. Je remercie en particulier:
Monsieur le Professeur Philippe THONART (Directeur de l’Unité de Bio-Industries de l’Université de Liège Gembloux Agro-Bio Tech et promoteur de cette thèse) pour m'avoir accueilli au sein de son unité; pour le temps qu’il m’a accordé, ses qualités pédagogiques et scientifiques, sa franchise et sa sympathie. Je lui adresse ma gratitude pour tout cela;
Monsieur le Professeur Philippe NOKI VESITULUTA (du Département de Chimie, Faculté des Sciences de l’Université de Kinshasa/R.D. Congo) pour ses conseils et son encadrement;
Madame Jacqueline DESTAIN (co-promoteur de cette thèse) et Monsieur Frank DELVIGNE, pour leur aide très précieuse au cours de ces quatre années, j’ai beaucoup appris à vos côtés;
Messieurs les Professeurs Jean-Michel KAUFFMANN et Jean-Paul WATHELET pour m’avoir ouvert les portes de leurs services;
Madame Céline PIERART et Monsieur Fréderic WEEKERS pour leurs conseils lors de la réalisation de ce travail;
Les membres du jury et du comité de thèse qui m’ont soutenu tout au long de ce parcours: Marianne SINDIC, Sabine DANTHINE, Micheline VANDENBOL, Frank DELVIGNE, Jean-Michel RONMEE et Jean-Michel KAUFFMANN;
Martine ALLEGAERT pour avoir encadré mes premiers pas en microbiologie, Samuel TELEK et Benoit MASSAUX pour m’avoir initié aux fermenteurs, Marie VANDEPUT pour sa disponibilité, le groupe SECHAGE pour le temps passé ensemble, Marina CHANET, Michelle VAN MARSENILLE, Françoise DECAMP et le Docteur Charles MUPWELENGE pour leur soutien;
Au personnel (chercheur et technicien) du CWBI qui m’a permis de réaliser ce travail dans une excellente ambiance;
La Coopération Technique Belge (CTB), la Wallonie Bruxelles Internationale (WBI) et la Région Wallonne à travers le projet CONSALIM pour leur soutien matériel et financier;
Les familles Chritophe KABELE, Crispin KALUBI, Roger KIZUNGU, Godé TSHIMONA, Martin MUBEMBE et Max LUSAMBA pour leurs conseils;
Les Pasteurs James et Jean de l’église Porte des brebis à Bandalungwa;
Mes amis: Firmin LANG, Boukraa SLIMANE, Papy EKAMAKETE, Axel MAKENGO, Alain MAMONI, Jean-Liévin KALONJI, Claudine MUANGISA, Nadine NGITUKA, Donato KAYA, Nelly MPANZU, Faustin MALEMBA, Julien MULENGA, Alfred MUKUNA, Eliane DIKHULU, Déo MANKOY, Bienvenu KAMBASHI, Dieudonné TSHAMALA, Pandisha THIMANGA, Sandra KABELE, Laetitia GBOTO, Haddy MBUYI, Roland FOMA, Charles YAPO, Michel MUSONI, Basile ZIHALIRWA, J-D LIONGE pour leur amitié.
Que toutes les personnes que j’ai oublié de citer trouvent dans ce dernier paragraphe mes sincères reconnaissances et mes remerciements distingués.

MPUTU KANYINDA Jean-Noël
ABRÉVIATIONS
AGPI        : Polyinsaturated fat acid
AOT	: Accelerated oxidation test 
AST	: Accelerated storage test 
ATP         : Adenosine triphosphate
aw	: Water activity
cFDA	: Carboxyfluoresceindiacetate 
CPE		: Extracellular cryoprotectant 
CFU	: Units forming colonies 
CG	: Cream with 2% glycerol 
CPI	: Intracellular cryoprotectant 
CS	: Cream without glycerol 
CWBI		: Walloon center of industrial biology 
D	: Decimal reduction time (h) 
DNA         : Deoxyribonucleic acid
DNTB	  	: 5, 5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid)
DW	: Dry Weight 
Ea	: Activation energy (J.mole-1)
EDTA	: Ethylenediaminetetraacetic acid 
ISR	: Induced Systemic Resistance 
FAME		: Fatty acid methyl esters 
FCM         : Flow cytometry 
FSC          : Forward Scatter 
HCN	: Hydrogen cyanide
4-HNE	: 4-hydroxynonenal
K	: Rate constant (h-1) 
k0	: Pre-exponential constant 
GSH	: Glutathione 
GSSG       : Glutathione oxidized
KOH	: Potassium hydroxide
MB	: Methylene bleu
MDA	: Malondialdehyde
NADP	: Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate
NO           : Nitric oxide
OD           : Optical density 
ΔP            : Back pressure
P1	: Powder with 2% glycerol, 5% maltodextrin and 0.2% ascorbic acid 
P2	: Powder with 2% glycerol and 0.2% ascorbic acid 
P3 & PS	: Powder without protective compound 
PBS          : Phosphate Buffered Saline
PCA	: Plate count agar;
PG	: Powder with 2% glycerol
pH	: Hydrogen potential
PI	: Propidium iodide 
PUFA	: Polyunsaturated fatty acid
O2-°          : Superoxide radical anion
OH°         : Hydroxyl radical
ONOO-    : Peroxynitrite
R	: Ideal gas constant (8.314 j mole k-1)
r²	: Correlation coefficient
R²	: R-squared
RNA         : Rubonucleic acid
ROS	: Reactive Oxygen Species
RPM        : Rotation per minute
S1	: Powder with 1% of glycerol, 10% of maltodextrin 
S2	: Powder without protective compound
T0            : Start of exposure
Tf             : End of exposure
T	: Absolute temperature (°K)
TCA	: Trichloroacetic acid
TNB	: 2-nitro-5 thiobenzoic acid
vvm          : volumes of air per volume of liquid per minute
z               : Thermal death time parameter (°C)

Table des matières

Table des matières
Publications scientifiques
I.	Symposiums, seminaires et congrès
II.	Formation au cours du doctorat
Introduction Générale
Chapitre I. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
1.	Pseudomonas fluorescens
1.2 Ecologie
1.3. Métabolisme
1.4. Caractéristique de la structure membranaire de la bactérie gram négative
Structure membranaire des bactéries
1.5. Applications de Pseudomonas fluorescens
2.	Généralités sur le séchage des micro-organismes
2.1. Introduction
2.2. Impact du séchage sur la viabilité des bactéries
2.3. Les dégâts oxydatifs cellulaires
2.4. Modifications de la structure membranaire
2.4.1	Peroxydation lipidique
2.4.2	L’oxydation des protéines
2.4.3	Dommage de l’ADN
3.	La cryoprotection des bactéries
4.	Conclusions
5.	Remerciements
6.	Bibliographie
Chapitre II. Impact des composes protecteurs sur Pseudomonas fluorescens BTP1
Introduction du Chapitre II
1.	Introduction
2.	Materials and methods
2.1 Organism
2.2 Production and freeze-drying
2.3 Conductivity
2.4 Measurement of cultivability
2.5 Fluorescent probes and staining protocols
2.6 Fatty acids analysis by gas-liquid chromatography
2.7 Statistical analysis
3.	Results and discussion
3.1 Viability of P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C
3.2 Cellular fatty acid composition
4.	Conclusion
5.	Acknowledgements
6.	References
Chapitre III. Impact de la lyophilisation et du stockage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens BTP1
Introduction du chapitre III
1.	Introduction
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and cultivation
2.2 Measurement of cultivability
2.3 Fluorescent probes and staining protocols for flow cytometry analysis
2.4 Fatty acids analysis by gas-liquid chromatography
2.5 Determination of cellular glutathione (GSH)
2.6 Protein determination
2.7 Statistical analysis
3.	Results
4.	Discussion
5.	Conclusion
6.	Acknowledgements
7.	References
Chapitres IV. Test accéléré de conservation de Pseudomonas fluorescens
Introduction du chapitre IV
1.	Introduction
2.	Materials and methods
2.1 Strains and pre-culture conditions
2.2 Production and freeze-drying
2.3 Packaging and storage
2.4 Thermal treatment
2.5 Kinetics parameters
2.6 Statistical analysis
3.	Results and discussion
4.	Conclusion
5.	Acknowledgment
6.	References
Conclusion du chapitre IV
Chapitre V. Test accéléré d’oxydation de Pseudomonas fluorescens
Introduction du chapitre V
1.	Introduction
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and cultivation
2.2 Photosensitisation
2.3 Water activity (aw) and survival rate
2.4 Protein carbonyl content
2.5 Fatty acid analysis by gas-liquid chromatography
2.6 Soluble proteins
2.7 Statistical analysis
3.	Results
4.	Discussion
5.	Conclusion
6.	Acknowledgements
7.	References
Conclusion du chapitre V
Chapitre VI. Optimisation de la production de Pseudomonas fluorescens BTP1 en fermenteur
Introduction du chapitre VI
1.	Introduction
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and growth
2.2 Preparation of freeze-drying
2.3 Measurement of cultivability and water activity (aw)
2.4 Statistical analysis
3.	Results
Bioreactor growth
Freeze-drying
Storage test
4.	Discussion
5.	Conclusion
6.	Acknowledgements
7.	References
Conclusion du chapitre VI
Discussion générale
Conclusions générales et perspectives
1.	Conclusions
2.	Perspectives
Tableaux et figures
Liste des tableaux
Liste des figures

Publications scientifiques
Mputu Kanyinda J-N., Pierart C., Weekers F., Destain J. and Thonart P., 2012.  Impact of protective compounds on the viability, physiological state and lipid degradation of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 during storage. Int. J. Biotechnol. Biochem.,8, 17-26.
Mputu Kanyinda J-N., Pierart C., Weekers F., Delvigne F, Wathelet J-P, Destain J. and Thonart P., 2012. Effects of glycerol on Pseudomonas fluorescens BTP1 freeze-dried. Int. J. Biotechnol. Biochem., 8, 245-258.
Mputu Kanyinda J-N., Destain J., Noki P., Thonart P., 2012. Accelerated storage test of freeze-drying Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains. Afr. J. Biotechnol. 11, 16187-16191.
Mputu Kanyinda J-N., Ben Oussaid N., Lusamba V., Noki P., Destain J., Thonart P., Delvigne F., 2013. Accelerated oxidation test of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains. (Sous presse).
Mputu Kanyinda J-N. and Thonart P.,2013. Optimisation of production, freeze-drying and storage of Pseudomonas fluorescens BTP1. Int. J. Microbiol. Res.5, 370-373.
Mputu Kanyinda Jean-Noël,  Pierart Céline, Destain Jacqueline, Noki Philippe, Thonart Philippe, 2013. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens. (Sous presse).
I.	Symposiums, seminaires et congrès
Participation avec poster au 17eme symposium sur la Biologie appliqué (KUL le 15 février 2012). «Impact of glycerol and storage temperature on glutathione concentration and physiological state of Pseudomonas fluorescens BTP1 freeze-dried» Mputu Kanyinda J-N., Pierart C., Delvigne F., Destain J., and Thonart P. 
Participation avec poster au congrès «European Plant Genetic Resources (EUCARPIA) Conference 2011: To Serve and Conserve» (Wagenigen du 5 au 7 avril 2011). «Study of viability of Pseudomonas fluorescens BTP1 freeze-dried during storage at 4 and 20°C». Mputu Kanyinda J-N., Pierart C., Delvigne F., Destain J. and Thonart P. 
Participation au séminaire «Structurer son document écrit» le 15 mai 2011, à l’Université de Liège Sart-Tilman.
Participation à la conférence «Les défis de l’Agriculture au Nord et au Sud» le 6 mars 2010 à l’Université de Liège Gembloux-Agro Bio Tech.
Participation au colloque sur les 50 ans d’indépendance du Congo «Contribution de la formation et de la recherche agronomique au développement durable du Congo» le 19 octobre 2010 à l’Université de Liège Gembloux-Agro Bio Tech.
Participation au symposium «One day symposium Chemical Entomology» le 5 mai 2010 à l’Université de Liège Gembloux-Agro Bio Tech.
Participation à «Ecole doctorale en Biotechnologie sur l’élargissement de l’Union Européenne et l’Agriculture des pays d’Europe centrale et orientale» le 13 mars 2010 à l’Université de Liège Gembloux-Agro Bio Tech, dans le cadre du 150eme anniversaire de Gembloux-Agro Bio Tech.
Participation à l’école de formation interdisciplinaire pour doctorant «Ecole doctorale, chimie, biotechnologie et matériaux» du 19 au 22 janvier 2010 à la Faculté des Sciences de l’Université Notre Dame de la Paix de Namur.
II.	Formation au cours du doctorat
Participation aux formations spécifiques CEFOCHIM-BioWin «Les techniques modernes et applications de la Chromatographie en Phase Gazeuse» du 11 au 13 juillet 2011, Zoning de Seneffe à Charleroi.
Participation aux formations spécifiques CEFOCHIM-BioWin «Les bonnes pratiques de validation au laboratoire» du 6 au 7 juin 2011, Zoning de Seneffe à Charleroi.
Participation aux formations spécifiques CEFOCHIM-BioWin «Introduction à la cytométrie en flux et ses applications; concevoir une expérience de cytométrie en flux» le 31 mai et 14 juin 2011, Zoning de Seneffe à Charleroi.

Introduction générale

Introduction Générale
Pseudomonas fluorescens est une bactérie Gram négative non sporulante. Elle est principalement utilisée en agriculture, comme stimulateur de croissance des plantes et comme biopesticides (Stockwell and Stack, 2007; Chakravarty and Kalita, 2011; Ongena et al., 1999), dans l’environnement pour son action sur la dégradation des hydrocarbures et d’autres polluants des eaux industrielles (Barathi and Vasudevan, 2001; Barry et al., 2009; Grishchenkov et al., 2000; Mahiudddin et al., 2012; Moneke et al., 2010; Pandey and Upadhyay, 2010), dans l’industrie chimique comme catalyseur dans la réaction de transestérification de l’huile de Jatropha pour la production de biodiesel (Devanesan et al., 2007) et en médecine pour le traitement de certaines infections cutanées (Mazereeuw-Hautier, 2006). La production du concentré bactérien de P. fluorescens, située en amont de leurs applications, peut représenter une activité industrielle importante. 
Pseudomonas fluorescens est soumis à différentes opérations au cours du traitement post-culture: refroidissement, concentration, cryopréservation, lyophilisation ou fluidisation et stockage à basse température (Palmfeldt et al., 2003; Perry, 1998; Vidhyasekaran et al., 1997). Cependant, l’objectif principal de cette filière industrielle est de produire des concentrés bactériens de haute qualité c’est-à-dire, comportant un nombre élevé de cellules viables et cultivables, avec une reprise maximale d’activité au cours de leur utilisation (Coulibaly et al., 2010; Carvhalo et al., 2004; Castro et al., 1995) et susceptible d’être conservés le plus longtemps possible. Et pourtant, ces opérations de production, de conditionnement et de stockage de P. fluorescens induisent un certain nombre de stress (biochimique, chimique, thermique et mécanique) à l’origine de la dégradation de leur état physiologique avec des conséquences directes sur leur qualité technologique (Miyamoto-Shinohara et al., 2008; Palmfeldt et al., 2003). Il est dès lors impératif de pouvoir maitriser l’ensemble de ces opérations en vue de l’obtention d’un concentré bactérien présentant des propriétés technologiques optimales lors de son utilisation. 
La lyophilisation est la technique la plus utilisée pour sécher et conserver les bactéries aussi bien dans la recherche que dans l’industrie. C’est une technique appropriée pour la production des concentrés bactériens, avec comme avantage que le produit lyophilisé peut être stocké à température ambiante. Cependant, elle cause des dommages à la cellule, conduisant à une perte de la viabilité au cours du séchage et du stockage (Palmfeldt et al., 2003; Miyamoto-Shinohara et al., 2008). 
P. fluorescens est très sensible à toute forme de séchage (Palmfeldt et al., 2003) ; et diverses techniques sont utilisées pour améliorer la survie. L’utilisation de composés protecteurs préserve les cellules contre les conditions environnementales néfastes (UV, oxydation, température) (Boyetchko et al., 1999). Les facteurs les plus importants qui affectent la viabilité de bactéries en général et de P. fluorescens lyophilisés en particulier sont : la température et l’humidité ou l’activité d’eau (aw). Il est essentiel pour la survie de P. fluorescens que l’activité de l’eau soit comprise entre 0,2 et 0,4 (Jorgensen et al., 1994). Il est également possible d’adapter la bactérie à des conditions de stress pendant sa production, afin de mieux résister à la congélation et à la lyophilisation.  
La phase stationnaire induit divers états physiologiques dans les cellules, en raison de la carence en carbone et de l'épuisement des sources de nutriments disponibles et les réponses au stress se déclenchent pour permettre d’améliorer la survie de la population cellulaire. Il est recommandé pour P. fluorescens de pouvoir récolter les cellules dans la phase stationnaire plutôt que dans la phase exponentielle, car les cellules stressées présentent une viabilité plus élevée après la lyophilisation que les cellules non stressées (Palmfeldt et al., 2003; Jørgensen et al., 1994). 
Des recherches plus approfondies visant à comprendre les mécanismes à l’origine de la perte de la viabilité cellulaire des bactéries après les opérations de séchage ont été menées pour les bactéries Gram positives (phénomènes d’oxydation membranaires, activité d’eau, etc.) (Castro et al., 1996; Coulibaly et al., 2009; Yao et al., 2008). Il a été démontré que les bactéries lyophilisées étaient exposées à des phénomènes d’oxydation au niveau membranaire, et que cette oxydation affectait les acides gras polyinsaturés. Ainsi, la perte de la viabilité au cours du stockage était en partie liée à cette oxydation. A ce jour, il n’y a pas d’étude menée sur la compréhension des mécanismes de la perte de viabilité chez P. fluorescens.
Vu ce qui précède, ce travail prend toute son importance. Il a pour but de comprendre les mécanismes responsables de la mortalité chez Pseudomonas fluorescens pendant les opérations de séchage et de stockage, ainsi que l’optimisation de la production en fermenteur. Les souches utilisées sont BTP1 (mésophile et souche de référence), BB2 et PI9 (thermophile). Ce mémoire de thèse est présenté sous forme d’essai structuré autour d’articles scientifiques. En accord avec les règlements de l’université de Liège-Gembloux Agro-Bio Tech, les chapitres en anglais sont précédés d’une introduction en français. Le document est subdivisé en six (6) chapitres. 
Le chapitre I, intitulé "Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens" donne une synthèse bibliographique sur le genre Pseudomonas fluorescens avec ces différentes applications ainsi que les principaux facteurs influençant sa mortalité au cours des différents procédés de séchage et de stockage (oxydation des acides gras membranaires, oxydation des protéines et de l’ADN). Ce chapitre est présenté sous forme d’une revue soumise à Biotechnology, Agronomy, Society and Environment (BASE). 
Le chapitre II parle de l’influence des composés protecteurs sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens. Les résultats obtenus dans ce chapitre portent : 
•	sur l’influence des composés protecteurs (glycérol et maltodextrin) sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens pendant la lyophilisation et au cours du stockage,
•	sur l’intégrité membranaire par la mesure de la conductivité électrique et par la cytométrie en flux,
•	sur l’oxydation lipidique par l’étude de la composition en acides gras membranaires.
Nos résultats montrent que P. fluorescens est très sensible au séchage et qu’il n’y a pas d’effets remarquables de ces protecteurs pendant la lyophilisation mais qu’ils influencent la stabilité au stockage. Les résultats de ces travaux ont été publiés dans « International Journal of Biotechnology and Biochemistry » avec comme titre « Impact of protective compounds on the viability, Physiological State and Lipid degradation of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 during storage ». 2012, article ISSN 0973-2691, 10 pages. 
Le chapitre III porte sur les différents dommages subis par la membrane cellulaire de P. fluorescens lyophilisé. Les résultats obtenus dans ce chapitre montrent : 
•	la dégradation des acides gras membranaires au cours du stockage par l’étude du ratio acides gras polyinsaturés sur C16:0,
•	la dégradation du glutathion, 
•	l’insolubilisation des protéines au cours du stockage. 
Une étude sur l’état physiologique de cellules avant et après la lyophilisation complète cette recherche. 
Il a été démontré dans ce chapitre que l’un des systèmes de défense de P. fluorescens, le glutathion était endommagé au cours du stockage rendant ainsi la cellule vulnérable aux attaques de l’oxygène sous toutes ses formes; et que la lyophilisation affecte plus la viabilité de P. fluorescens BTP1 que le stockage. De plus, l’insolubilisation des protéines est liée à l’augmentation de la mortalité au cours du stockage. Les résultats de ce chapitre ont permis la compréhension des phénomènes à la base de la mortalité cellulaire chez P. fluorescens lyophilisé. Ces résultats ont été publiés dans « International Journal of Biotechnology and Biochemistry » avec comme titre « Effect of glycerol on Pseudomonas fluorescens BTP1 freeze-dried ». 2012, article ISSN 0973-2691, 11 pages. 
Le chapitre IV porte sur le test accéléré de mortalité (test d’Arrhenius). Les résultats ayant fait l’objet de cette étude confirment que P. fluorescens est très sensible aux températures élevées au cours de son stockage. Nous avons comparé trois différentes souches de P. fluorescens dont deux thermophiles en provenance de l’Algérie (BB2 et PI9) et une mésophile (BTP1) du Centre Wallon de Biologie Industrielle. Trois températures ont été testées 4, 37 et 60°C, seule la BB2 a montré une certaine résistance par rapport à la BTP1 et la PI9. Les résultats ont aussi montré que leur énergie d’activation (Ea) et la variation de température nécessaire (z) pour réduire d’un facteur 10 le temps de réduction décimal (D) ne sont pas significativement différentes. Les résultats de ces travaux ont été publiés dans «African Journal of Biotechnology» avec comme titre «Accelerated storage test of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains». ». 2012, article ISSN 1684-5315, 5 pages.
Le chapitre V porte sur le test accéléré d’oxydation par exposition des poudres de Pseudomonas fluorescens lyophilisées à l’oxygène singulet produit par photosensibilisation du bleu de méthylène à la lumière. Ces résultats montrent que le matériel biologique des poudres lyophilisées de Pseudomonas fluorescens est oxydé par l’oxygène singulet. Cela s’est traduit par une baisse considérable de la viabilité, par l’oxydation des acides gras polyinsaturés, par une insolubilisation des protéines et par une augmentation des groupements carbonyles. Les résultats de ces travaux ont été soumis dans «Journal of Molecular Microbiology and Biotechnology» avec comme titre «Accelerated oxidation test of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains ».
Le chapitre VI de ce travail se penche sur les mécanismes d’optimisation de la production et de la conservation de Pseudomonas fluorescens à l’échelle industrielle. Elle est subdivisée en deux grandes étapes. La première étape est basée sur les conditions de culture de Pseudomonas fluorescens en fermenteur pour une optimisation du rendement, la récolte des cellules et le conditionnement avant la lyophilisation. La seconde étape qui est la plus critique pour la survie de Pseudomonas fluorescens est la lyophilisation et le conditionnement dans un emballage adéquat, sa maitrise garantira la stabilité du produit final sec. Les résultats de ces travaux sont publiés dans «International Journal of Microbiology Research» avec comme titre «Optimization of production, freeze-drying and storage of Pseudomonas fluorescens BTP1». 2013, article ISSN 0975-5276, 4 pages.
La discussion générale, résume et discute l’ensemble des résultats des travaux qui ont donné lieu à la rédaction de publications. Les travaux sur l’impact des composés protecteurs pendant la lyophilisation des P. fluorescens ainsi que les tests accélérés de stockage et d’oxydation ont permis d’améliorer les conditions de conservation de nos poudres. Notre travail n’a pas permis de cerner ce qui se déroule pendant la lyophilisation. La discussion porte alors sur la détermination de la viabilité cellulaire, sur les phénomènes responsables de la perte de viabilité de la poudre lyophilisée de Pseudomonas fluorescens au cours de sa conservation, sur le système antioxydant, sur les mécanismes de lutte contre les stress oxydatifs et sur l’optimisation de la production en fermenteur de P. fluorescens. Cette discussion permet de dégager des voies pour l’optimisation de la production de  la poudre de P. fluorescens. Une conclusion générale ainsi que des perspectives pour des recherches futures seront exposées à la fin de cette thèse. 
Bibliographie
Barathi, S., and Vasudevan, N. (2001). Utilization of petroleum hydrocarbons by Pseudomonas fluorescens isolated from a petroleum-contaminated soil. Environmental International 26, 413-416.
Barry, H., M.D, C., Eoin, S., and Eoin, C. (2009). Treatment of fluoroacetate by a Pseudomonas fluorescens biofilm grown in membrane aerated biofilm reactor. Environmental Science and Technology 43, 6776-6785.
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Chapitre I. Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens

Impact du séchage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens
Publication 1- Biotechnol. Agro. Soc. Environ.
Biotechnology, Agronomy, Society and Environment

Mputu Kanyinda Jean-Noël (1,2), Pierart Céline(3), Destain Jacqueline (1), Noki Philippe (2), Thonart Philippe (1)
(1) Université de Liège-Gembloux Agro-Bio Tech, Dpt. de Chimie et Bio-industrie. Passage des Déportés, 2. B-5030 Gembloux (Belgique). E-mail : kanyinda2004@gmail.com.
(2) Université de Kinshasa, Faculté des Sciences, Dpt. de Chimie. Mont-Amba, B.P. 190 KinXI. Kinshasa (R.D.Congo).
(3) Artechno SA, rue Camille Hubert, 17-Crealys Science Park, 5032 Isnes/ Gembloux, Belgique.

Remerciements
Nous remercions très sincèrement la Coopération Technique Belge et la Wallonie Bruxelles pour leur soutien financier.

*  Corresponding author: Centre Wallon de Biologie Industrielle, Passage des déportés n°2
Tel.+32.81.62.23.05, Fax.+32.81.61.42.22, E-mail:kanyinda2004@gmail.com.

Résumé
Le séchage de Pseudomonas fluorescens rend plus économique sa conservation, son transport et sa commercialisation. Il a pour but d’arrêter et de stabiliser toute activité biologique en vue d’une conservation optimale, compatible avec la préservation d’une viabilité maximale. La viabilité des bactéries après séchage dépend des conditions opératoires de ce dernier. L’un des critères les plus importants à considérer lors du séchage de produits biologiquement actifs est la qualité du produit final sec. La lyophilisation est la méthode de séchage la plus utilisée pour Pseudomonas. Mais les changements de température induits par le séchage ne sont pas sans conséquence pour les cellules. Ils sont responsables des altérations cellulaires (peroxydation des acides gras), de l’oxydation des protéines et de l’ADN. L’utilisation de composés protecteurs avant la lyophilisation permet de réduire les phénomènes d’oxydation tout en maintenant une viabilité élevée au cours du stockage.
Mots-clés. Acide gras, composé protecteur, lyophilisation, oxydation, Pseudomonas, viabilité.
Abstract
The drying Pseudomonas fluorescens makes more economical storage, transportation and marketing. It aims to stop and to stabilize all biological activity for an optimal storage, compatible with the conservation of maximum viability of microorganisms desired. The viability of bacteria after drying depends on the operating conditions of the latter. One of the most important criteria to consider during the drying of biologically active products is the quality of the final dried product.  Freeze-drying is the most drying method used for Pseudomonas. But temperature changes it induced are not without consequence for the cells. They are responsible for cell damage (peroxidation of fatty acids) and genetic (proteins and DNA oxidation). However, use of protective compounds during freeze-drying and during storage increases significantly the rate of cell viability.
Keys words: Fatty acids, freeze-drying, oxidation, protective compounds, Pseudomonas, viability. 

1.	Pseudomonas fluorescens
1.1 Introduction 
Pseudomonas fluorescens est une bactérie Gram négative, fermentant le glucose mais pas le lactose, oxydase positive en forme de bâtonnet avec des flagelles polaires qui lui assurent la mobilité. C’est une bactérie ubiquitaire rencontrée dans les sols, sur les racines des végétaux, sur les plantes, ainsi que dans les eaux douces et marines (Charan et al., 2011; Wong et al., 2011). Elle appartient à la classe des Gammaproteobacteria, famille des Pseudomonadacea et au genre Pseudomonas. La fluorescence est due à la production d’un pigment fluorescent jaune-vert appelé pyoverdine, soluble dans l’eau et insoluble dans le chloroforme (Wong et al., 2011; Paulsen et al., 2005; Gao et al., 2012; Trögl et al., 2012). Sa température de croissance optimale se situe entre 25 et 30 °C.
1.2 Ecologie
Pseudomonas fluorescens est une espèce commensale chez les plantes, leur permettant d’atteindre les éléments nutritifs indispensables à leur croissance. Il dégrade les polluants et produit des antibiotiques. Cette espèce est connue pour son aptitude à réduire l’incidence des maladies racinaires des plantes, ainsi qu’à inhiber la croissance d’un grand nombre d’agents phytopathogènes (Aremu et al., 2010; Gao et al., 2012; Akram et al., 2008). Cette inhibition résulte de plusieurs mécanismes incluant la production d’une large gamme de métabolites antagonistes et de sidérophores. Ces derniers ont une grande affinité pour le fer et engendrent donc une compétition avec d’autres organismes du sol (Dhanya and Potty, 2007; Bhattacharya, 2010). On note également pour certaines souches une capacité à induire les mécanismes de défense chez la plante, mais dans la plupart des cas d’inhibition, le facteur déterminant est la production d’antibiotiques agissant directement sur l’agent pathogène (Walsh et al., 2001; Charde and Dawande, 2010).
1.3. Métabolisme
Pseudomonas fluorescens a des besoins nutritionnels simples et peut facilement se développer dans des milieux minéraux complétés par une variété de sources de carbone, certaines souches peuvent utiliser l’ion nitrate (NO3-) comme accepteur d’électrons en lieu et place de l’O2. Il produit de la pyoverdine, responsable de la chélation de fer (Bhattacharya, 2010). Il produit également certaines enzymes stables à la chaleur (lipases et protéases) qui sont impliquées dans l’altération du lait (Bakker et al., 2007; Charde and Dawande, 2010) ; mais aussi certains antibiotiques (2,4-diacetylphloroglucinol, phenazines, pyrrolnitrine, HCN etc…) qui contribuent à la protection contre les pathogènes (Walsh et al., 2001; Anand and Kulothungan, 2010; Paulsen et al., 2005). 
1.4. Caractéristique de la structure membranaire de la bactérie gram négative
Structure membranaire des bactéries
La paroi cellulaire des bactéries Gram négatives est fine et élastique; elle est couverte d’une membrane externe contenant les lipides liés de manière covalente à des polysaccharides tandis que celle des bactéries Gram positives est épaisse et rigide (Coulibaly, 2010; Coulibaly et al., 2008; Volodymyr, 2010). Les bactéries Gram négatives ont une couche de peptidoglycane de 5 à 10 nm environ d'épaisseur entre les membranes plasmiques intérieure et extérieure, tandis que l'épaisseur de cette couche est d'environ 20 à 80 nm chez les bactéries Gram positives (Figure 1) (Beveridge, 1999; Tripathi et al., 2012). Les parois cellulaires des bactéries Gram négatives, avec une couche plus mince de peptidoglycane que celle des bactéries Gram positives, ont tendance à se rompre plus facilement pendant les processus de dessiccation et de réhydratation (Pembrey et al., 1999).

Figure 1.  Différence entre la paroi d’une bactérie Gram négative et Gram positive d’après Tripathi et al. (2012)
L’absence d’acide techoïque  chez les bactéries Gram négatives réduit encore leur résistance au séchage par rapport aux bactéries Gram positives. Enfin la plupart des bactéries Gram négatives ont des lipopolysaccharides sur leur surface, ces lipopolysaccharides peuvent piéger des molécules d'eau, entraînant une baisse des taux de survie au cours du stockage à long terme (Miyamoto-Shinohara et al., 2010; Miyamoto-Shinohara et al., 2008).
1.5. Applications de Pseudomonas fluorescens
Pseudomonas fluorescens a plusieurs applications, les plus connues concernent l’agriculture où elle est utilisée en lutte biologique et comme stimulateur de croissance des plantes PGPB (Plant Grown Promoting Bacteria) (Anita and Samiyappan, 2012; Couillerot et al., 2009; Ongena et al., 2000; Ongena et al., 2005; Russo et al., 2005; Gao et al., 2012). P. fluorescens combat plusieurs infections des plantes, leurs modes d’action dans la suppression des maladies des plantes incluent les sidérophores pour la compétition du fer disponible, l’antibiose, la production d’enzymes lytiques et le Système de Résistance Induit (ISR) (Anita and Samiyappan, 2012; Bakker et al., 2007; Ongena et al., 2005; Ongena et al., 1999; Paulsen et al., 2005; Russo et al., 2005). Il est également utilisé comme catalyseur dans la réaction de transestérification de l’huile de Jatropha pour la production de biodiesel (Devanesan et al., 2007). Pseudomonas fluorescens joue aussi un rôle dans la protection de l’environnement par la dégradation des hydrocarbures et d’autres types de polluants (Lemire et al., 2010; Pandey and Upadhyay, 2010; Moneke et al., 2010). Pseudomonas fluorescens est actuellement étudié en médecine car elle produit un antibiotique particulier (mupirocine) qui a prouvé son efficacité dans le traitement de certaines maladies de la peau, des troubles oculaires et auditifs (Mazereeuw-Hautier, 2006). 
2.	Généralités sur le séchage des micro-organismes
2.1. Introduction
Les souches microbiennes, qu’il s’agisse de bactéries, de levures ou de moisissures, nécessitent un conditionnement stable durant une longue période en vue de leur commercialisation (Zamora et al., 2006). Les cellules microbiennes se conservent rarement à l’état natif dans leur milieu de culture. Leur croissance est souvent réalisée en fermenteur dans un substrat liquide mais conservées dans ce milieu après leur croissance, les cellules y consomment les derniers nutriments disponibles et révèlent, pour la plupart, un métabolisme fermentaire qui nuit à la qualité du produit (modification du pH, émanation d’odeurs, etc.). De plus, les cellules, après avoir épuisé leurs réserves, meurent en grand nombre. Il est donc nécessaire de stabiliser la population microbienne et le séchage des cellules apparaît comme une solution pratique (Zhao and Zhang, 2005; Coulibaly et al., 2011). 
Le séchage des micro-organismes a pour but de leur assurer une conservation optimale, compatible avec la préservation d’une viabilité maximale, et rendre ainsi plus économique leur stockage, leur transport et leur commercialisation (Demirhan and Özbek, 2010; Bossart and Halloin, 2001). Il existe plusieurs techniques de séchage des microorganismes appliquées à l’échelle industrielle à savoir l’atomisation (Bucio et al., 2005; Coulibaly et al., 2011), la fluidisation (Li et al., 2004) et la lyophilisation (Coulibaly et al., 2009; Palmfeldt et al., 2003; Nanasombat and Sriwong, 2007; Perry, 1998; Zhao and Zhang, 2005). Ces méthodes sont assez agressives vis-à-vis des micro-organismes puisqu’elles soumettent ces derniers à des variations plus ou moins importantes de température et ou de pression. Par ailleurs, des effets liés au flux d’eau à travers les membranes cellulaires peuvent également être déterminants sur la qualité du produit séché (Bossart and Halloin, 2001; Coulibaly et al., 2011). Ces techniques entrainent des dommages à la membrane cellulaire, comme une peroxydation lipidique, une dénaturation des protéines et de l'ADN conduisant in fine à une perte de viabilité (Zhao and Zhang, 2005). De toutes ces techniques, la littérature indique que la lyophilisation apparaît la plus utilisée en dépit de son coût, pour le séchage et la conservation des bactéries en général et des Pseudomonas spp. en particulier car elle est adaptée pour les souches sensibles à des températures élevées (Vidhyasekaran and Muthamilan, 1995; Palmfeldt et al., 2003; Harrison and Pelczar, 1963).
2.2. Impact du séchage sur la viabilité des bactéries
Le séchage a un impact direct sur la viabilité des bactéries. Il existe plusieurs facteurs qui influencent directement cette viabilité, il s’agit notamment de facteurs physiques (Lievense and Riet van't, 1994; Coulibaly et al., 2011; Morgan et al., 2006) mais aussi de facteurs biologiques (Miyamoto-Shinohara et al., 2008; Lievense and Riet van't, 1993). Les bactéries Gram positives résistent mieux à la lyophilisation comme les bactéries lactiques (Castro et al., 1995; Nanasombat and Sriwong, 2007; Perry, 1998; Selmer-Olsen et al., 1999) tandis que leurs homologues Gram négatives, et notamment Pseudomonas et  Escherichia coli sont très sensibles à toute forme de séchage surtout en l’absence de composés protecteurs (Palmfeldt et al., 2003; Louis et al., 1994). Cette différence de résistance au séchage entre les bactéries Gram positives et Gram négatives est principalement due à la composition de leur paroi cellulaire. Il a été établi que la température, l’exposition à la lumière et l’humidité relative affectent la stabilité des bactéries lyophilisées au cours de leur stockage et favorisent les phénomènes d’oxydation (Coulibaly et al., 2010; Teixeira et al., 1996). D’autres aspects affectant la survie des bactéries pendant le séchage sont notamment l’acidité, la concentration de la biomasse et les réactions d’oxydation (Lievense and Riet van't, 1994). Une forte concentration d’acide est nuisible à la cellule tandis que la concentration élevée d’autres composants par exemple les sels dans le milieu provoque une augmentation de la pression osmotique pouvant conduire à la plasmolyse de la cellule (Lievense and Riet van't, 1994). Les travaux réalisés par Palmfeldt et al. (2003) ont montré que le fait de récolter les cellules après la phase stationnaire leur permettait de s’adapter aux conditions des stress et améliorer leur viabilité après le séchage tandis que Jørgensen et al., (1994) ont confirmé qu’il était essentiel pour la survie de P. fluorescens que l’activité de l’eau soit comprise entre 0,2 et 0,4. 
2.3. Les dégâts oxydatifs cellulaires
Le séchage et la conservation rendent les bactéries vulnérables aux phénomènes d’oxydation et sont responsables de différentes formes de dommages cellulaires. La lyophilisation entraine des dommages à la membrane cytoplasmique, une modification de la composition des lipides, une altération de l’ADN/ARN et une dénaturation des protéines (Santivarangkna et al., 2008; Lievense and Riet van't, 1994). Tous ces changements conduisent à la perte de la viabilité (Nanasombat and Sriwong, 2007; Palmfeldt et al., 2003). L’oxydation des lipides membranaires est l’une des principales causes de la mortalité cellulaire durant le stockage (Halliwell and Chirico, 1993; Lievense and Riet van't, 1994). Castro et al. (1995) et Coulibaly et al., (2009) ont démontré que les dommages subis par la membrane cellulaire de Lactobacillus durant son stockage étaient en partie dus à la présence de l’humidité relative et à une température de stockage élevée. Jusqu’à ce jour, peu d’études ont été menées sur la compréhension des mécanismes responsables de la perte de viabilité chez les bactéries Gram négatives séchées. Israeli et al., (1993) ont montré que l’exposition à l’air et à la lumière augmentaient le taux de mortalité d’Escherichia coli et de Pseudomonas syringae. Palmefeldt et al. (2003) ont émis l’hypothèse selon laquelle la perte de viabilité des bactéries était en partie due à l’oxydation de l’ADN.
2.4. Modifications de la structure membranaire
La structure membranaire est la première cible de la détérioration de l’état physiologique des cellules lors d’une situation de stress (Béal et al., 2008), ce qui conduit à une rupture de la paroi cellulaire (Lievense and Riet van't, 1994). Le dommage subi par la membrane cytoplasmique est principalement dû à la déshydratation, ce qui a comme conséquence le relargage en solution des composants intracellulaires (cations, nucléotides, enzymes, protéines, etc.) des cellules lyophilisées au cours de leur réhydratation (Yao et al., 2008; Lievense and Riet van't, 1994). Les températures élevées modifient les propriétés des molécules hydrophobes (acides gras) de la membrane et les interactions solvant-protéines au cours du séchage. Cela se traduit entre autres par une diminution de la stabilité des interactions hydrophobes entre deux molécules apolaires (acides aminés) au sein des membranes, par une modification de la configuration des protéines membranaires pouvant entraîner leur dénaturation (Mazur, 1970), et par la modification de la composition lipidique de la membrane au cours du stockage (Coulibaly et al., 2011; Coulibaly et al., 2010). Cette situation de stress pousse les cellules à utiliser leurs propriétés d’autodéfense contre ces phénomènes d’oxydation (production du glutathion,  de la superoxyde dismutate etc.) (Luqman and Rizvi, 2006; Leslie et al., 1995). Le glutathion est un tripeptide utilisé comme marqueur du degré de stress environnemental. Il protège les cellules contre les sous-produits générés par le métabolisme oxydatif en maintenant l’intégrité cellulaire et participe aux principaux processus cellulaires tels que la synthèse des protéines, la régulation de l’activité enzymatique, la synthèse de l’ADN. Tandis que la superoxyde dismutase détruit les radicaux toxiques aux systèmes biologiques (Leslie et al., 1995; Luqman and Rizvi, 2006).
2.4.1	Peroxydation lipidique
Pendant la lyophilisation et au cours du stockage, les bactéries subissent d’intenses phénomènes de dégradation, liés pour la plupart à l’oxydation des lipides membranaires. Ces réactions d’oxydation sont les principaux facteurs déterminant la durée de vie des cellules (Coulibaly et al., 2011). La peroxydation lipidique est un phénomène général qui se produit en présence d’oxygène. Tous les lipides contenant des acides gras insaturés sont concernés. Coulibaly et al. (2008) ; Yao et al. (2008) ont montré chez les bactéries Gram positives que les acides gras polyinsaturés étaient les premières cibles des attaques des radicaux libres au cours de leur stockage à l’état sec et génèrent des peroxydes lipidiques qui sont très réactifs. Ils ont également établi une relation entre la perte de la viabilité et la diminution du ratio acides gras polyinsaturés/ acides gras saturés (U/S) de cellules de Lactobacillus lyophilisées. Coulibaly et al. (2009) ont montré que les acides gras polyinsaturés avec au moins deux doubles liaisons étaient plus facilement oxydés. Cette peroxydation lipidique fournit une grande variété de produits, dont certains réagissent avec les protéines et l’ADN. Parmi ceux-ci, citons : le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal (4-HNE) qui sont les plus étudiés comme marqueurs de la peroxydation lipidique (Marnet, 1999; Yao et al., 2009). Les mécanismes en chaine de la dégradation des acides gras membranaires conduisent à la formation d’hydroperoxydes instables (ROOH) responsables de la diminution de la fluidité membranaire, de la dénaturation des protéines et du DNA, de la diminution de la perméabilité et de la sensibilité des membranes (Alberts et al., 2012). 
2.4.2	L’oxydation des protéines
Comme pour les lipides, la lyophilisation et le stockage entraine des dommages aux protéines, étant donné que leur structure dépend partiellement de l’eau. Ces protéines forment avec l’eau des liaisons qui sont rompues lors de la lyophilisation, conduisant ainsi à leur dénaturation. Les composés carbonyles réactifs tels que le ribose, le diacétyle et le pyruvate, doivent être enlevés de la suspension cellulaire avant la lyophilisation parce qu’ils peuvent réagir avec les groupes aminés des composants cellulaires essentiels et rendre ainsi les protéines vulnérables aux phénomènes d’oxydations (Lievense and Riet van't, 1994). Les réactions d’oxydations des protéines modifient les résidus d’acides aminés (lysine, arginine, proline et hystidine) et génèrent des fragments carbonylés identifiés comme marqueurs de l’oxydation des protéines (Jha and Rizvi, 2011; Luqman and Rizvi, 2006; Wong et al., 2011; Suzuki et al., 2010) (Figure 2). 

Figure 2. Le mécanisme de la modification oxydative des protéines (d’après Petropoulos, 2011)
Les protéines les plus sensibles aux attaques radicalaires sont surtout celles qui comportent un ou plusieurs groupements sulfhydryles (SH). Leslie et al. (1995) ont montré que les protéines modifiées par oxydation s’insolubilisent et deviennent  beaucoup plus sensibles à l'action des protéases.
2.4.3	Dommage de l’ADN
Bien que le dégât subit par la membrane cellulaire pendant la lyophilisation joue un rôle essentiel dans la perte de viabilité, les dommages des composants cellulaires (ADN et ARN) affectent considérablement la viabilité des cellules lyophilisées. L’ADN est très sensible au séchage comme démontré chez E. coli (Santivarangkna et al., 2007). Les modifications observées après l’oxydation de l’ADN sont très nombreuses, il s’agit entre autres de la conversion des résidus thymine en thymine glycol et en 5-hydroxyméthyluracile, de la guanine en 8-hydroxyguanine, l’oxydation du désoxyribose entraîne une coupure des brins. En effet, la guanine est la cible privilégiée de nombreux oxydants (Cadet et al., 1995; Cadet et al., 2003; Kumari et al., 2008; Saumaa et al., 2007).
3.	La cryoprotection des bactéries
La lyophilisation a longtemps été considérée comme la technique de déshydratation appropriée pour les bactéries (Santivarangkna et al., 2008; Palmfeldt et al., 2003; Morgan et al., 2006). Le choix d’un composé protecteur appropriés est très important pour assurer une viabilité élevée  des bactéries pendant la lyophilisation et au cours du stockage (Lievense and Riet van't, 1993; Leslie et al., 1995; Kawahara, 2008). 
Tableau 1. Quelques caractéristiques et substances utilisées comme cryoprotecteurs intracellulaires (CPI) et extracellulaires (CPE) d’après Coulibaly et al. (2011).
              Caractéristiques               Intracellulaires (CPI)               Extracellulaires (CPE)	
Poids moléculaire (g/mol)                                        <400                                                      >10000
Activité à une concentration de l’ordre                 de la mole (M)                                  de la millimole (mM)
Exemples de molécules utilisées                        glycérol, méthanol,                         lactose, saccharose, tréhalose       
                                                                        éthanol, dyméthylsulfoxyde              polyvinyl pyrrolidone, dextran
                                                                     polyéthylène oxyde (PEO-400)                  maltodextrin, amidon	
Ces composés protecteurs doivent être peu volatils, solubles dans l’eau et n’avoir aucun caractère toxique au niveau cellulaire. Ils ont des origines diverses : polyols, sucres, protéines laitières, acides aminés, antioxydants ou macromolécules (Béal et al., 2008). Le Tableau 1 nous donne les différentes classes des composés protecteurs. 
Yao et al. (2008 et 2009) ; Coulibaly et al., (2009 et 2010) ont prouvé pour les bactéries Gram positives que plus l’activité d’eau est basse mieux est la conservation des poudres lyophilisées. Dans ce système, l'activité de l’eau influence les réactions d’oxydation des lipides, car l'eau permet la mobilisation, favorise la formation des substances pro-oxydantes. En général, une activité de l’eau (aw) comprise entre 0,2 et 0,3 correspond aux vitesses d’oxydation les plus faibles. Par contre, une  aw comprise entre 0,6 et 0,8 correspond aux vitesses d’oxydation les plus grandes (Coulibaly et al., 2011). De nombreux auteurs dont Harrison and Pelczar, (1963) ; Daigle et al. (2002) et Palmfeldt et al. (2003) ont mis en évidence l’apport des composés protecteurs sur la viabilité de Pseudomonas lors des opérations de séchage (tableau 2). 
Tableau 2. Viabilité des Pseudomonas après les différentes opérations de séchage.
       Souches                    technique               [CFU/ml]              [CFU/g]                     auteurs 
                                                                    avant séchage     après séchage            	
Pseudomonas sp               Lyophilisation          7,8x109                         1,3x109 (a)         
P. fluorescens                                                    1,0x1010                3,2x107 (a)            Harrison et Pelczar, 1963
P. chlororaphis                                                  4,4x109                 6,8x107 (a) 
P. chlororaphis                 Lyophilisation          3,5x109                 9,1x108 (a)  
                                                                                                        3,5x106 (b)            Palmfeldt et al., 2003  
P. fluorescens BRG100    Fluidisation              3,1x109                 6,6x106 (a)            Daigle et al., 2002                           	
(a)	Poudre avec composé protecteur, (b) poudre sans composé protecteur
4.	Conclusions 
La lyophilisation reste à ce jour la technique la mieux adaptée pour le séchage et la conservation de Pseudomonas fluorescens, car elle permet l’obtention d’une poudre ayant une viabilité assez élevée comparativement à celle obtenue par atomisation ou par fluidisation. Les conditions opératoires d’obtention et de conservation d’une poudre  ayant une meilleure activité métabolique sont relativement bien connues chez les bactéries Gram positives, mais pas chez les Gram négatives. Cependant, les mécanismes de leur altération restent obscurs à ce jour. La connaissance de certains paramètres responsables de la perte de viabilité de P. fluorescens pendant leur lyophilisation et au cours de leur stockage permettra de résoudre le problème lié à leur conservation et aussi à leur transport. Dans le souci d’optimiser la conservation de la poudre lyophilisée de P. fluorescens, certaines techniques et voies de recherches doivent être explorées. Nous retenons parmi elles, l’étude des modifications subies par les structures cellulaires au cours des traitements de séchage et de conservation (la composition en acides gras membranaires, l’oxydation des acides gras, l’oxydation des protéines et l’oxydation de l’ADN) ainsi que l’utilisation d’un emballage adéquat (imperméable à la lumière et à l’oxygène).
5.	Remerciements 
Nous remercions très sincèrement la Coopération Technique Belge (CTB) et la Wallonie Bruxelles International (WBI) pour leur soutien financier.
6.	Bibliographie
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Chapitre II. Impact des composes protecteurs sur Pseudomonas fluorescens BTP1

Introduction du Chapitre II
La lyophilisation est la technique la plus utilisée pour sécher et conserver Pseudomonas fluorescens. Mais elle n’est pas sans conséquence pour les cellules car elle affecte l’intégrité de la membrane ce qui a pour conséquence, la perte de la viabilité au cours du stockage. La poudre obtenue après lyophilisation est très vulnérable aux attaques de l’oxygène sous différentes formes. Il est donc important de conditionner la poudre dans un emballage imperméable à l’oxygène et à la lumière pour limiter cette oxydation. A côté de cet aspect, les composés protecteurs sont de plus en plus utilisés pour stabiliser les bactéries avant et après la lyophilisation. Ces composés protègent la poudre de bactéries lyophilisées contre les différents dommages auxquels elle est exposée à savoir l’oxydation lipidique et la rupture membranaire conduisant à une perte considérable de la viabilité. L’effet du glycérol qui est un cryoprotecteur intracellulaire est comparé à celui de la maltodextrine qui est un cryoprotecteur extracellulaire pendant la lyophilisation et au cours du stockage de P. fluorescens BTP à 4°C et 20°C. 

Impact of protective compounds on the viability, physiological state and lipid degradation of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 during storage.
                                                         Publication 2 – Int. J. Biotechnol. Biochem.
International Journal of Biotechnology and Biochemistry.

Mputu Kanyinda Jean-Noël1, 2*, Pierart Céline.1, Weekers Frédéric.3, Destain Jacqueline.1 and Thonart Philippe1
(1) Walloon Center of Industrial Biology, University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech,2 Passage   des Déportés, 5030 Gembloux Belgium.
(²) Chemistry Department, Faculty of Sciences, University of Kinshasa, BP 190 Kin XI, Kinshasa/ DRCongo.
(3)Artechno SA, rue Camille Hubert, 17, Crealys Science Park, 5032 Isnes / Gembloux Belgium.

* Corresponding Author: Mputu Kanyinda Jean-Noël, Phone: +3281622305, Fax: +3281614222
   E-mail:kanyinda2004@gmail.com 

Abstract
The drying of bacteria remains a major alternative for long-term storage. After centrifugation, a bacterial pellet of Pseudomonas fluorescens BTP1 was divided in two fractions, i.e. one with protective compounds (2% glycerol or 5% maltodextrin) and one without, and freeze-dried. After freeze drying, powders were sealed in aluminium bags under vacuum and stored at 4°C or 20°C. Parameters such as viability, conductivity and the ratio of polyunsaturated fatty acids to saturated fatty acids were used to investigate the viability of freeze-dried powders during storage. For example, the cell concentration of the powder with glycerol (PG) before storage was 4x109 CFU/g, and after 7 months was 2x108 CFU/g at 4°C and 3.5x107 CFU/g at 20°C. The ratio of polyunsaturated fatty acids/saturated fatty acids decreased as a function of time (e.g. at 4°C, the ratios of C18:3 and C18:2 to C16:0 decreased from 0.013 to 0.001 and 0.05 to 0.03 after 60 days of storage, respectively). In the present study, flow cytometry was applied to evaluate the physiological state of the cells at the end of the storage period. We compared the survival results of bacteria obtained by plate counting with the results of flow cytometry.

Keywords: Bio-fungicide, protein, flow cytometry, protective compounds, cellular fatty acids

1.	
Introduction
Pseudomonas fluorescens are commonly used as bioherbicides to replace chemical herbicides in agriculture, but it requires some formulation (into a liquid or powder) for its transport and/or its use (Liu et al., 2009; Daigle et al., 2002). Freeze-drying is a commonly used method to preserve bacteria, in research as well as in industry. This technique is suitable for the production of concentrated bacterial cultures, with the advantage that the dried material can be stored at ambient temperature and be easily transported (Coulibaly et al., 2009; Yao et al., 2008; Rojas et al., 2006; Palmfeldt et al., 2003).
However, this technique brings about undesirable side effects, such as modifications in the physical state of membrane lipids and in the structure of sensitive proteins, causing a decrease in cell viability during processing as well as during subsequent storage (Palmfeldt et al., 2003; Nanasombat and Sriwong, 2007; Zhao and Zhang, 2005). Consequently, some compounds such as polyols, polysaccharides, disaccharides, amino acids, proteins, vitamins, and various salts have been examined for their potential roles in improving the survival of bacteria throughout the freeze drying process. Previous studies (Miecznikowski and Lenart, 2010; Schoug et al., 2007; Crowe et al., 2001; Selmer-Olsen et al., 1999; Coulibaly et al., 2008) have reported that lipid oxidation of membrane fatty acids is responsible for cell death during storage for Lactobacillus plantarum.
In living organisms, lipids, particularly polyunsaturated fatty acid (PUFA) components of cell membranes, are described as being extremely sensitive to environmental stress. Loss of viability is related to a decrease in the ratio of unsaturated to saturated fatty acids during storage (Coulibaly et al., 2008; Teixeira et al., 1996). Different species display different degrees of freeze-drying survival, with Gram-negative bacteria often showing lower survival than Gram-positive bacteria (Palmfeldt et al., 2003). Therefore, understanding the effect of these protective compounds and their formulations is important for developing viable freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1.
The aim of our work was to study and understand the factors responsible for cell death during freeze-drying and during storage at 4°C and 20°C. In this work, the viability of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 was evaluated by measuring conductivity, the number of viable cells by the plate count agar (PCA) method and flow cytometry, as well as the membrane fatty acid composition before and after the drying process and during storage. The effects of temperature and protective compounds were also investigated.
2.	Materials and methods
2.1 Organism
The strain used in our study was Pseudomonas fluorescens BTP1 from Walloon Centre of Industrial Biology (CWBI) (Ongena, 1996).
2.2 Production and freeze-drying
Pseudomonas fluorescens BTP1 was grown in a 100 l bioreactor (Biolafite) containing 60 l of 863 medium, for 20 hours and then concentrated 20 times by centrifugation at 4700 rpm. After centrifugation, the pellet was divided in two parts, one with and one without protective compounds (2% w/w glycerol or 5% w/w maltodextrin) and freeze-dried in a LOUW KOELTECHNIEK BVBA freeze-drier with a standard program by increasing the temperature gradually from -25°C to 25°C at 0.9 mbar pressure for 48 h (Yao et al., 2008; Coulibaly et al., 2009; Jørgensen et al., 1994; Boyetchko et al., 1999; Yao et al., 2008).
2.3 Conductivity
For the analysis, 1 g of powder was soaked in MilliQ water (10 ml) for 4 h at room temperature. The conductivity (ms/cm.g) of the solution was measured using a conductivity meter (EC 215) according to a previously described method (Yao et al. 2010).
2.4 Measurement of cultivability
Cultivability of cells was evaluated by plate counts and compared with cytometry results after 210 days. After serial dilutions in peptone water, cells were plated onto solid 868 agar and incubated at 30°C for 24 h (Rault et al., 2007). Each result is the geometrical mean of at least three counts.
2.5 Fluorescent probes and staining protocols
Carboxyfluorescein diacetate (cFDA) was used to assess P. fluorescens BTP1 viability, whereas the nucleic acid dye, propidium iodide (PI), made it possible to quantify damaged and dead cells. Before staining, cell suspensions of P. fluorescens BTP1 were diluted in peptone water at 0.2 optic density to 590 nm, centrifuged 2 minutes at 12000 rpm, and the pellets were resuspended in 1ml PBS buffer to reach approximately 106 cells/ml. One milliliter of the diluted suspension was supplemented with 10 µL of cFDA and incubated for 15 min at 37°C for viability assessment, or with 10 µl of PI and incubated for 30 min at 37°C for membrane integrity assessment (Bunthof et al., 2001; Rault et al., 2007). Live/dead assays were done by dual staining of each sample to differentiate viable, dead and stressed cells. The same dye concentrations were used. The diluted suspension was first incubated with 10 µL of PI and 10 µl of cFDA for 15 min. After centrifugation (Fischer Bioblock Scientifik) and rinsing three times at 12000 rpm for 1 minute in 1 ml of PBS buffer, cell pellets were resuspended in 1 ml of PBS buffer before analysis by flow cytometry (Rault et al., 2007; Bunthof et al., 2001).
The subpopulations were identified using dot plots. Gates were defined in the dot plots of FSC, SSC, green fluorescence and red fluorescence, thus allowing the software to separate the different events. Before analysis, detectors were adjusted and compensation setting was performed on a sample with unstained cells. The corresponding signal on the dot plots was set in the lower left quadrant in order to eliminate cellular auto-fluorescence. Data were analyzed with the aid of statistical tables, which indicated the percentages of stained cells determined by each detector (Rault et al., 2007).
2.6 Fatty acids analysis by gas-liquid chromatography
Total lipids were extracted overnight from dried cells (1g) with chloroform-methanol (2:1 v/v) mixture. Saline solution NaCl 0.88% (w/v) is added in order to obtain 2 phases shakes overnight. The lower organic phase contains all lipids excepted gangliosides. Chloroform-methanol extracts were pooled, filtered, and then evaporated and concentrated under reduced pressure at 35°C. Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared from the concentrate with 14% (w/w) solution of boron trifluoride (BF3) in methanol as regent (Sigma, St Louis, MO, USA). After heating at 70 °C in a water bath for 90 min, 0.5 ml of saturated NaCl, 0.2 ml of sulphuric acid (10%) and 0.5 ml of n hexane were added. The methylated fatty acids were taken from the upper phase after decanting. Gas chromatographic analysis of the methyl esters was carried out on an HP 6890 (Hewlett Packard) gas chromatograph equipped with a flame ionization detector at 250 °C (Coulibaly et al., 2009). A capillary column (30x0.25 mm) was used. Helium was used as carrier gas (2.4 ml/min) and the injection volume was 1 µl. The injection was done at 250 °C in splitless mode for 1 min. The oven temperature was held at 50 °C for 1 min, increased by 30 °C/min to 150 °C, and then from 150 °C to 240 °C at 4 °C/min with a final hold of 10 min at 240 °C. Fatty acid methyl esters were identified by comparing their retention times with standard mixtures FAME MIX 47885U (Supelco, Bellefonte, USA). The relative fatty acid content was estimated as a percentage of the total peak area using a DP 700 Integrator. The relative content (%) of palmitic (C16:0) acid for two reasons: first C16:0 had the highest proportion at most points relative to other fatty acids and second C16:0 did not change significantly during storage.
2.7 Statistical analysis
Data from three replicates were analysed by analysis of variance to determine if significant differences (P ≤ 0.05) existed between mean values. CFU counts and flow cytometry results were transformed by log10.
3.	Results and discussion

a

3.1 Viability of P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C
Drying bacteria remains a major alternative for long-term storage. After centrifugation, the bacterial pellet of P. fluorescens BTP1 was conditioned with or without protective compounds (2% w/w glycerol or 5% w/w maltodextrin) and freeze-dried. After freeze drying, powders were sealed in aluminium bags under vacuum and stored at 4°C or 20°C. The storage stability of freeze-dried powders was studied by parameters such as the loss of viability by PCA method, electrical conductivity and changes in membrane composition by studying the ratio of unsaturated to saturated fatty acids. Viability (CFU/g) of P. fluorescens powder during storage at 4°C or 20°C was determined using a previously published procedure (Kurtmann et al., 2009). Samples were analysed singly (three plates per treatment) in an experiment that was duplicated. In the present study, flow cytometry was applied to evaluate cellular injury in response by storage and data obtained after counting are compared with those obtained by flow cytometry.  Table 3 shows the viability of P. fluorescens BTP1 after 270 days storage at 4 or 20°C. The best viability was obtained for the freeze-dried powder with maltodextrin. For example, at 4°C, PS decreased from 1.9x1010 to 1.3x107 CFU/g, PG decreased from 4x109 to 1.5x108 CFU/g and PM decreased from 4.7x1010 to 1.5x108 CFU/g, whereas at 20°C, PS decreased from 1.9x1010 to 5x106, PG decreased 4x109 to 7x107 CFU/g and PM decreased from 4.7x1010 to 3x107 CFU/g. By comparing both protective compounds, glycerol provided the best viability during storage.

Table 3. Concentration of P. fluorescens BTP1 (log CFU/g) after 7months of storage at 4°C and 20°C
	                             	       4°C			20°C		
Time (days)	  PS	    PG	  PM	   PS	PG	PM	
							
0
15
30
45
60
160
210	10.2±0.1
9.5±0.1
9.5±0.1
8.6±0.1
7.9±0.2
7.8±0.1
7.1±0.0	9.8±0.2
9.8±0.2
9.6±0.2
9.5±0.2
9.1±0.1
8.9±0.1
8.8±0.0	10.7±0.3
9.9±0.1
10.1±0.1
9.9±0.1
9.8±0.1
8.8±0.1
8.8±0.1	10.2±0.1
9.1±0.1
8.7±0.2
7.7±0.1
7.3±0.2
7.2±0.1
6.3±0.0 (7.5)	9.8±0.2
9.4±0.1
8.5±0.1
8.0±0.1
7.2±0.3
7.2±0.2
7.2±0.2 (7.7)	10.7±0.3
9.4±0.1
8.5±0.1
8.0±0.1
7.3±0.4
7.4±0.2
7.5±0.2 (7.9)	
* Brackets indicate the flow cytometry values after 210 days of storage at 20°C.
Results presented in figure 3 shows that the loss of cell viability of during storage was related to increase in electrical conductivity. This loss of viability was more pronounced at 20°C than at 4°C; like Gram-positive bacteria, loss of viability during the first 10 days of storage is important. The viability of freeze-dried P. fluorescens BTP1 stored seven months at 20°C, was compared to the flow cytometry results (table 3). Flow cytometry allows the determination of cell physiological state (viable cells, dead cells and viable but non-cultivable cells) after a double staining by PI and cFDA (Miao et al., 2009).
Flow cytometry shows that the majority of cells are in an intermediate state (90.5% of viable but not cultivable cells). As shown in figure 4 that freeze-drying and storage leads to a decline the viable cells concentration with and an increase in the number of intermediate cells.

4°C

 

20°C

Figure 3. Survival CFU/g and electrical conductivity of P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C. Powder without protective compounds (PS), powder with maltodextrin (PM) and powder with glycerol (PG)

Results presented above on freeze-drying and storage of P. fluorescens BTP1 are better than those found by Daigle et al., 2002 on the strain of P. fluorescens BRG 100. These results show that storage temperature and freeze-drying affect membrane integrity and the viability of P. fluorescens BTP1. It is now established that use of protective compounds is essential for freeze-drying and storage of P. fluorescens (Coulibaly et al., 2009; Zhao and Zhang, 2005).

3

2

1

1

2

3

Figure 4. P. fluorescens BTP1 after PI/cFDA double staining. 1. Powder without protective compounds (PS), 2. Powder with 5% maltodextrin (PM). 3. Powder with 2% glycerol (PG) at 20°C.
3.2 Cellular fatty acid composition
Freeze-drying causes damages to the cytoplasmic membrane of P. fluorescens BTP1, as shown by increased electrical conductivity, the decrease viability and flow cytometry analysis. The membrane lipids play an important role in cytoplasmic membrane permeability. As in Gram-positive bacteria, membranes damage causes changes in the lipid profile (Coulibaly et al., 2009). Teixeira et al. (1996) demonstrated that oxidation of membrane lipids mainly fatty acid was responsible for cell death during storage.
Table 4 shows the fatty acids profiles of P. fluorescens BTP1 before and after freeze-drying. The relative percentages of the six main peaks of P. fluorescens BTP1 cellular fatty acids are presented. The main peaks were identified in relation to their retention times compared with standards as: palmitic acid (C16:0), palmitoleic acid (C16:1), stearic acid (C18:0), oleic acid (C18:1), linoleic acid (C18:2) and linolenic acid (C18:3). Four of these six fatty acids have been previously identified in the cellular membrane of P. fluorescens (Fouchard et al., 2005; Suutari and Laakso, 1994). Figure 5 shows that the polyunsaturated fatty acids of the powder without protective compound (PS) were the most affected by the freeze-drying (for example 1.6% C18:2 before freeze-drying to 0.7% after freeze-drying; 2.7% C18:3 before freeze-drying to 1.5% after freeze-drying). 

Figure 5. C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios of Pseudomonas fluorescens BTP1 during 60 days storage at 4°C or 20°C in vacuum-sealed aluminium foil.    : Powder without protective compounds (PS),     : powder with 5% maltodextrin (PM),     : powder with 2% glycerol 

Table 4. Cellular fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens before and after freeze-drying
Treatment                                                              	                                       Relative content (%)             	
	    C16 :0         C16 :1         C18 :0        C18 :1        C18 :2        C18 :3	
 Before freeze-drying      PS     54.2±0.1       16.3±0.8      4.5±0.4       20.7±0.2     1.6±0.4       2.7±0.3 
                                         PG    55.2±0.6        17.4±0.2      3.3±0.5       19.9±1.0     1.4±0.0       2.8±0.6
                                         PM    55.9±0.4       18.1±0.9      3.6±0.9      19.3±0.7     1.3±0.2       1.8±0.5                                                                                  
 After freeze-drying         PS     53.8±0.7       17.0±0.8      5.5±0.1       21.5±1.0     0.7±0.1       1.5±0.1
                                         PG    54.5±1.3        19.9±0.3      3.0±0.5       19.2±0.3      0.8±0.3      2.6±0.2
                                         PM    56.2±1.1       16.0±0.9      4.1±0.2        21.1±0.3     1.0±0.1      1.6±0.4                                                                           	
The six main fatty acids are palmitic (C16:0), pamitoleic (C16:1), stearic (C18:0), oleic (C18:1), linoleic (C18:2) and linolenic (C18:3). PS, pellet without protective compounds; PG, pellet with 2% glycerol and PM, pellet with 5% maltodextrin.
Changes in membrane structure are often demonstrated by measuring the ratio of polyunsaturated to saturated fatty acid. This ratio decrease during storage, as shown in Figure 5, indicating that freeze-drying induced lesions in cellular lipid structures. Similar results were obtained for Gram positive bacteria (Teixeira et al., 1996; Coulibaly et al., 2010). This decrease in unsaturated fatty acids due to oxidation was quantified on the basis of the ratios between each polyunsaturated fatty acid peak area and the palmitic acid peak area, since saturated fatty acids are not altered by oxidation.
Figure 5 shows the changes in the polyunsaturated to saturated fatty acids ratio after freeze-drying and during storage. It was found that the polyunsaturated to saturated fatty acids ratio decreased at 4°C and at 20°C under all storage conditions. This decrease was more pronounced for the powder without protective compounds, which leads us to conclude that protective compounds slowed the oxidation phenomenon during freeze-drying and during storage. 
4.	Conclusion
The results presented here provide experimental support to the hypothesis that freeze-drying and storage cause damage to P. fluorescens membranes. The loss of viability during storage at 4°C or 20°C was associated with an increase in electrical conductivity and a decrease in the C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios. Our results confirm the importance of protective compounds before freeze-drying to minimise the loss of viability and lipid oxidation during storage. These results further support the view that PUFAs (linoleic and linolenic acids) plays a key role in determining cellular susceptibility to oxidation and/or heat stress. Flow cytometry showed that after storage 210 days at 20°C majority of cells were in an intermediate state (viable but no cultivable). Flow cytométrie in combination with the plate count method, could be used as a predictive test for a description of the physiological state of bacteria. 
5.	Acknowledgements
Mputu Kanyinda Jean-Noël thanks the Belgium Technical Cooperation (BTC) and Walloon Region for their financial assistance.
6.	References 
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Conclusion du Chapitre II
Il est donc possible de conserver par lyophilisation P. fluorescens BTP1 non seulement à l’échelle de laboratoire mais aussi à l’échelle industrielle. Nous avons mis en exergue les rôles des composés protecteurs pour améliorer la viabilité après la lyophilisation et au cours du stockage. Le conditionnement de la poudre lyophilisée sous vide dans un emballage en aluminium, permet de réduire les phénomènes d’oxydation lipidique liés à la présence de l’oxygène. Cet emballage est non seulement imperméable à l’oxygène mais aussi aux rayonnements ultraviolets de la lumière. La conservation est meilleure à 4°C plutôt qu’à 20°C en présence ou non des composés protecteurs. Il n’y a pas une grande différence dans la composition des acides gras polyinsaturés entre les deux températures, mais par contre l’intégrité membranaire est plus affectée à 20°C en l’absence des composés protecteurs. En comparaison de ces deux composés protecteurs utilisés dans ce chapitre, le glycérol permet de conserver une viabilité élevée au cours du stockage, tandis que la maltodextrine protège bien les cellules pendant la lyophilisation. Pour optimiser la lyophilisation et la conservation de P. fluorescens, la combinaison de ces deux composés protecteurs pourrait être capitale. Un accent particulier devrait être mis sur l’activité d’eau qui reste encore élevée dans nos poudres.

Chapitre III. Impact de la lyophilisation et du stockage sur la viabilité de Pseudomonas fluorescens BTP1

Introduction du chapitre III
Le souci majeur des microbiologistes et des industriels est de produire les concentrés bactériens ayant une viabilité élevée après les opérations de séchage et durant la conservation. Il est donc nécessaire d’identifier les différents paramètres responsables de cette perte de viabilité en vue de l’optimisation de la production de P. fluorescens BTP1 à l’échelle industrielle. Cette partie du travail a pour but de comprendre les facteurs responsables de la perte de viabilité chez P. fluorescens BTP1 pendant les opérations de séchage et de stockage. Les études menées sur l’oxydation lipidique par le dosage des acides gras membranaires, sur l’insolubilisation des protéines, sur l’état physiologique des cellules et sur le système antioxydant de défense chez P. fluorescens BTP1 (glutathion GSH) doivent permettre de mieux comprendre ces mécanismes. La cytométrie en flux doit permettre de caractériser l’état physiologique des cellules.

Effects of glycerol on Pseudomonas fluorescens BTP1 freeze-dried

Publication 3 – Int. J. Biotechnol. Biochem.
International Journal of Biotechnology and Biochemistry.

Mputu Kanyinda Jean-Noël1, 2*, Pierart Céline.1, Weekers Frédéric.3, Delvigne Frank.1, Destain Jacqueline.1, Wathelt Jean-Paul2, and Thonart Philippe1

1 Walloon Center of Industrial Biology , University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech, Passage des déportés, 2-5030 Gembloux Belgium.
² Chemistry Department, Faculty of Sciences, University of Kinshasa, BP 190 Kin XI, Kinshasa/ DRCongo.
3 Artechno SA, rue Camille Hubert, 17- Crealys Science Park, 5032 Isnes Gembloux Belgium.
4 General and Organic Chemistry Unit, University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech, Passages des Déportés 2-5030 Gembloux, Belgium.

* Corresponding Author: Mputu Kanyinda Jean-Noël, Phone: +3281622305, Fax: +3281614222, e-mail:kanyinda2004@gmail.com 

Abstract
The storage stability of freeze-dried powders was studied by parameters such as loss of viability on the Plate Count Agar (PCA). Powder with glycerol (PG) contains 8.4x1010 CFU/g before storage 1.1x1010 CFU/g after 3 months at 4°C and 6.0x108 CFU/g after 3 months at 20°C. The concentration of soluble proteins (mg/g) decreases during storage at 4°C from 3.77 to 0.80 after 90 days; and the ratios of unsaturated to saturated fatty acids (C18:3/C16:0 and C18:2/C16:0) decrease respectively from 0.05 to 0.04 and 0.007 to 0.004 after 3 months at 4°C. This ratio characterises the membrane fluidity. Powder without glycerol (PS) contains 1.1x1010 CFU/g before storage and 1.4 x 108 CFU/g after 3 months at 4°C and 1.4x107CFU/g after 3 months at 20°C. The concentration of soluble proteins (mg/g) decreases during storage at 4°C from 4.08 to 0.42 after 90 days, the glutathione concentration decreases during storage at 4°C from 2.2 to 1.4. The beneficial effect of glycerol on fatty acid composition during freeze-drying is shown and the ratios of unsaturated to saturated fatty acids (C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0) decrease respectively from 0.019 to 0.004 and 0.054 to 0.036 after 90 days storage at 4°C. Analysis by flow cytometry was used to assess the physiological state in which cells are at the end of freeze-drying. We found 13.5% live cells, 36.1% dead cells and 50.4% cells in an intermediate state for powder with glycerol (PG) after freeze-drying. These results show that glycerol plays an important role in P. fluorescens BTP1 desiccation during freeze-drying, by maintaining a degree of viability after freeze-drying and during storage.

Keywords: Bio-fungicide, cellular fatty acids, flow cytometry, glutathione, protein.

1.	
Introduction
Some ﬂuorescent pseudomonads are referred to as plant growth-promoting rhizobacteria (PGPR) and their effectiveness in controlling a number of plant diseases caused by soil-borne pathogens has been widely documented (Bakker et al., 2007; Ongena et al., 1999). Pseudomonas spp. can colonise the roots of crop plants and produce antifungal metabolites represent a real alternative to the application of chemical fungicides (Walsh et al., 2001). P. fluorescens is interesting in agriculture and horticulture bio-control as a fungicide. For this use, powder is generally produced to assure facilities and longer life of the product. Freeze-drying is most convenient, common and successful method of preserving bacteria (Walsh et al., 2001; Liu et al., 2009). 
Freeze-drying is a technique suitable for production of concentrated bacterial cultures with the advantage that the dried material can be stored at ambient temperature and easily transported (Palmfeldt et al., 2003; Coulibaly et al., 2009). But, this technique brings about undesirable side effects, such as modifications in the physical state of membrane lipids and proteins altered, causing the loss of cell viability during the process as well as during subsequent storage. Lipid oxidation of membrane cells was deemed responsible for cell death during freeze-drying and during storage (Garait et al., 2005; Nanasombat and Sriwong, 2007; Teixeira et al., 1996). In our previous study, we had shown lipid oxidation by the decrease of polyunsaturated fatty acids (C18:2 and C18:3) and the importance of protective compounds to minimize loss of cell viability. These data support further the view that polyunsaturated fatty acids (linoleic and linolenic acids) play a key role in determining cellular membrane susceptibility to oxidative or heat stress and glycerol has been the best protective compounds (Mputu Kanyinda et al., 2012b). 

This oxidation was often due to the reactive oxygen species (ROS). This ROS can damage proteins, modify bases and sugars in deoxyribonucleic acid (DNA) (Blair, 2008). In the dry state bio-molecules become more susceptible to the attack of oxygen (Garait et al., 2005). It is reported that the presence of antioxidants increased the survival rate of dried bacteria during storage (Carvalho et al., 2003; Coulibaly et al., 2009). Most cells possess several key mechanisms to limit their exposure to ROS. One of the major components of cellular antioxidant defenses is the glutathione. When cells are exposed to oxidant species such as H2O2, O2, reduced glutathione (GSH) is oxidized (O'Malley et al., 2004; Richard et al., 1997). In addition to its key role in maintaining the proper oxidation state of protein thiols in bacteria, glutathione also serves a key function in protecting the cell from the action of low pH, chlorine compounds, and oxidation and osmotic stresses (Masip et al., 2006). The consumption of glutathione during storage could inquire us about the oxidation phenomena. The viability of cultures is traditionally quantified by the plate count technique, which tests the ability of the cells to reproduce on an appropriate medium. Although colony counting is the conventional method for quantitative survival studies, this technique has three major drawbacks. 
Firstly it requires a long incubation time (24–72 h), depending on the bacterial species), secondly it often leads to an underestimation of viable cell counts as a result of cell clumping and chain formation and thirdly it only takes the bacteria that replicate under the conditions provided for growth into account. As a consequence, some cells, which are known as viable but non-cultivable, are not counted by this method, just like the cells that are dead, sub lethally damaged, injured, inhibited, dormant or inactive. Nevertheless, they may return to a physiological active state when suitable conditions are subsequently restored (Kaprelyants et al., 1999; Raaijmakers et al., 1999). Alternative techniques for viability assessment are desired for fundamental as well as routine microbiology research, although they have to be rapid and reliable. Flow cytometry (FCM) is an appealing technique for fast viability assessment (Bunthof and Tjakko, 2002; Bunthof et al., 2001). The first objective of the present study was to evaluate the impact of freeze-drying and glycerol effect on P. fluorescens BTP1 by using whole-cell fatty acid methyl ester (FAME) and flow cytometry analysis; the second objective was to evaluate the cell oxidation by glutathione and protein level during storage.
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and cultivation
The strain used in our study is P. fluorescens BTP1 of Walloon Center of Industrial Biology laboratory (CWBI). The strain was grown in 100 L bioreactor (Biolafitte) containing 60 liters of 863 mediums, for 20 hours and then concentrated 20 times by centrifugation (Sorval RC 12 BP) at 4700 rpm. After that, pellets were divided in two parts, one with protective compound 2% w/w glycerol and one without (Coulibaly et al., 2009; Mputu Kanyinda et al., 2012b)  and freeze-dried in a freeze-drier (LOUW KOELTECHNIEK BVBA) with a standard program by increasing the temperature gradually from -25°C to 25°C at 0.9 mbar pressure during 48h (Jørgensen et al., 1994; Yao et al., 2010).
2.2 Measurement of cultivability
Cultivability of cells was evaluated by Plate Counts Agar. After serial dilutions in peptone water, cells were plated onto solid 868 agar and incubated at 30°C for 24 h. Each result was the geometrical mean of at least three counts (Coulibaly et al., 2009). 
2.3 Fluorescent probes and staining protocols for flow cytometry analysis
Carboxyfluorescein diacetate (cFDA) was used to assess P. fluorescens BTP1 viability, whereas the nucleic acid dye, propidium iodide (PI), made it possible to quantify damaged and dead cells. Before staining, cell suspensions of P. fluorescens BTP1 were diluted in peptone water at 0.2 optic density to 590 nm, centrifuged 2 minutes at 12000 rpm, and the pellets were resuspended in 1ml PBS buffer to reach approximately 106 cells/ml. One milliliter of the diluted suspension was supplemented with 10 µL of cFDA and incubated for 15 min at 37°C for viability assessment, or with 10 µl of PI and incubated for 30 min at 37°C for membrane integrity assessment (Bunthof et al., 2001; Rault et al., 2007). Live/dead assays were done by dual staining of each sample to differentiate viable, dead and stressed cells. The same dye concentrations were used. The diluted suspension was first incubated with 10 µL of PI and 10 µl of cFDA for 15 min. After centrifugation (Fischer Bioblock Scientifik) and rinsing three times at 12000 rpm for 1 minute in 1 ml of PBS buffer, cell pellets were resuspended in 1 ml of PBS buffer before analysis by flow cytometry (Rault et al., 2007; Bunthof et al., 2001).
The subpopulations were identified using dot plots. Gates were defined in the dot plots of FSC, SSC, green fluorescence and red fluorescence, thus allowing the software to separate the different events. Before analysis, detectors were adjusted and compensation setting was performed on a sample with unstained cells. The corresponding signal on the dot plots was set in the lower left quadrant in order to eliminate cellular auto-fluorescence. Data were analyzed with the aid of statistical tables, which indicated the percentages of stained cells determined by each detector (Miao et al., 2009; Rault et al., 2007).
2.4 Fatty acids analysis by gas-liquid chromatography
Total lipids were extracted overnight from dried cells (1g) with chloroform-methanol (2:1 v/v) mixture. Saline solution NaCl 0.88% (w/v) is added in order to obtain 2 phases shakes overnight Folch method modified (Folch et al., 1957). The lower organic phase contains all lipids excepted gangliosides. Chloroform-methanol extracts were pooled, filtered, and then evaporated and concentrated under reduced pressure at 35°C. Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared from the concentrate with 14% (w/w) solution of boron trifluoride (BF3) in methanol as regent (Sigma, St Louis, MO, USA). After heating at 70 °C in a water bath for 90 min, 0.5 ml of saturated NaCl, 0.2 ml of sulphuric acid (10%) and 0.5 ml of n hexane were added. The methylated fatty acids were taken from the upper phase after decanting. Gas chromatographic analysis of the methyl esters was carried out on an HP 6890 (Hewlett Packard) gas chromatograph equipped with a flame ionization detector at 250 °C (Coulibaly et al., 2009; Mputu Kanyinda et al., 2012b). A capillary column (30x0.25 mm) was used. Helium was used as carrier gas (2.4 ml/min) and the injection volume was 1 µl. The injection was done at 250 °C in splitless mode for 1 min. The oven temperature was held at 50 °C for 1 min, increased by 30 °C/min to 150 °C, and then from 150 °C to 240 °C at 4 °C/min with a final hold of 10 min at 240 °C. Fatty acid methyl esters were identified by comparing their retention times with standard mixtures FAME MIX 47885U (Supelco, Bellefonte, USA). The relative fatty acid content was estimated as a percentage of the total peak area using a DP 700 Integrator. The relative content (%) of palmitic (C16:0) acid for two reasons: first C16:0 had the highest proportion at most points relative to other fatty acids and second C16:0 did not change significantly during storage.
2.5 Determination of cellular glutathione (GSH)
1 g of powder was washed at least 108 cells with PBS, then suspend to a cell density of 108 cells per ml in PBS and transfer the cells to a micro-centrifuge tube (Fischer Bioblock Scientifik). Cells were centrifuged at 600 x g to obtain a packed cell pellet, the supernatant was removed and the volume of the pellet was measured, 3 volumes of the 5% SSA solution were added to the packed cell pellet and vortexes. Freeze and thaw the suspension twice (use liquid nitrogen or a freezer at - 80 °C to freeze and a 37 °C bath to thaw) and leave for 5 minutes at 2–8 °C. Centrifuge the extract at 10,000 x g for 10 minutes and measure the volume of the supernatant and use this as the original sample volume in the calculation for glutathione determination. Keep the sample at 2–8 °C. For the assay procedure, there may be a need for sample dilution (up to 20-fold) in order to stay in the detection range. The measurement of GSH uses a kinetic assay in which catalytic amounts (nmoles) of GSH cause a continuous reduction of 5, 5’-dithiobis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB) to TNB and the GSSG formed is recycled by glutathione reductase and NADPH. The GSSG present will also react to give a positive value in this reaction (Fahey et al., 1978; Nair et al., 1991; Smirnova and Oktyabrsky, 2005; Wright and Viola, 1998).

nonenzymatic

                                      2 GSH + DTNB                            GSSG + 2 TNB

glutathionereductase

                             GSSG + NADPH + H+2                           GSH + NADP+

glutathionereductase

GSSG/GSH

                           NADPH + H++ DTNB                            2 TNB + NADP+

The reaction rate is proportional to the concentration of glutathione up to 2 mM. The yellow product, 5-Thio-2-Nitrobenzoic acid (TNB) is measured spectrophotometrically at 412 nm. The assay uses a standard curve of reduced glutathione to determine the amount of glutathione in the biological sample.
2.6 Protein determination
1 g of P. fluorescens BTP1 powder was washed twice by centrifugation (14000g, 30 minutes at 4°C) with 10 ml of Tris 50mM, pH 8.8. The cells were then lysed 3 minutes by sonication (Bandelin Sonoplus HD 2070) in Tris-EDTA (50mM, pH 8.8). After sonication, centrifugation is performed (24,000g, 15 minutes at 4°C) to remove cells and cellular debris crushed. The supernatant containing soluble proteins was assayed by Bicinchoninic Acid Protein Assay kit from Sigma (Brown et al., 1989; Chart, 1995).
2.7 Statistical analysis
Data from three replications were analyzed by using analysis of variance to determine if significant differences (P≤0.05) existed between mean values.
3.	Results 
Table 5 shows the six main fatty acids recovered from cell pellets with and without glycerol before and after freeze-drying and Error! Reference source not found. shows the survival CFU/g of freeze-drying P. fluorescens BTP1 strain during 90 days storage at 4 and 20°C. Error! Reference source not found. shows the evolution of the soluble protein concentration level of P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C and Figure 8 shows the ratios of polyunsaturated fatty acid by saturated fatty acid (C18:3 and C18:2 by C16:0) of P. fluorescens BTP1 freeze-dried during storage at 4°C and 20°C; this ratio indicates that freeze-drying and storage induces lesions on membrane lipids. Error! Reference source not found. shows the consumption of glutathione (GSH) in P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C, this consumption shows that we have an oxidation phenomenon of glutathione. Error! Reference source not found. shows the physiological state of the cell (P. fluorescens BTP1 pellet and powder) after PI/cFDA double staining by Flow cytometry.
4.	Discussion
After freeze-drying, powders with and without glycerol were sealed in aluminium bags under vacuum and stored at 4 or at 20°C. The storage stability of freeze-dried powders was studied using parameters such as viability by using a Plate Count Agar (PCA). Powder without glycerol (PS) contains 1.1 x 1010 CFU/g before storage; after 90 days storage we have 1.4 x 108 CFU/g at 4°C and 1.4 x 107 CFU/g at 20°C.We have a decrease of a factor 100 for powder stored at 4°C and a decrease of a factor 1000 for the powder stored for 20°C. Loss of viability is more pronounced at 20°C than at 4°C. Powder with glycerol (PG) contains 8.4x1010CFU/g before storage and after 90 days storage we have 1.1x1010CFU/g at 4°C and 6x108CFU/g at 20°C. 

Figure 6. Survival CFU/g of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 during 90 days storage at 4°C and 20°C (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)

We have a decrease of a factor 10 for powder stored at 4°C and a decrease of a factor100 for the powder stored at 20°C. It was found that, regardless of packaging mode or storage temperatures, the viability of the freeze-dried decreased as the storage time increased. As predictable the powder with glycerol has better viability than the powder without glycerol. 
We observe a decrease of protein level during storage, the concentration of soluble protein (mg/g) decreases during storage. For powder without glycerol we have 4.08 mg/g of powder before storage and after 90 days storage we have 0.42 mg/g of powder at 4°C and 0.27 mg/g of powder at 20°C. We have for the powder with glycerol 3.77 mg/g of powder before storage and after storage 0.80 mg/g of powder at 4°C and 0.61mg/g of powder at 20°C.

Figure 7. Evolution of the concentration of soluble protein during storage at 4 and 20°C of Pseudomonas fluorescens BTP1 powder (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)

This decrease in protein concentration is a function of time and storage temperature. We observe a greater decrease at 20°C them at 4°C, but it is more pronounced for the powder without glycerol than the powder with glycerol. The decrease of protein concentration shows that proteins are altered and insolubilized during storage and proteins are more altered in the powder without glycerol than the powder with glycerol.
The pellets with and without glycerol were analysed for fatty acid determination before and after freeze-drying, results are reported in table 5. The fatty acid composition of P. fluorescens BTP1 was characterized in order to better understand the damage suffered by the cell membrane during freeze-drying and storage. This result shows the relative percentage of fatty acid before and after freeze-drying. We have six main fatty acids in P. fluorescens BTP1 cellular membrane. Palmitic acid (C16:0) is the majority fatty acid in P. fluorescens BTP1, the addition of glycerol before freeze-drying allows to maintain fatty acids C18:2 and C18:3 (Mputu Kanyinda et al., 2012b).

 
Table 5. Cellular fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens BTP1 before and after freeze-drying
Treatment	                                             Relative content (%)	
	  C16 :0         C16 :1        C18 :0         C18 :1        C18 :2       C18 :3	
 Before freeze-drying       CS         54,4±0,2      16,1±0,3     4,1±0,1       21,1±0,2     1,7±0,1       2,6±0,1
                                         CG        55,0±0,3      17,6±0,2     4,1±0,2       19,1±1,0      1,6±0,3       2,6±0,2
  After freeze drying         CS         53,7±0,1      17,1±0,2     4,6±0,1       22,4±1,0      0,9±0,2      1,3±0,3
                                         CG        54,8±1,3      19,3±0,0     3,5±0,2      19,0±0,1       1,0±0,2       2,4±0,2	
The six main fatty acids are palmitic (C16:0), pamitoleic (C16:1), stearic (C18:0), oleic (C18:1), linoleic (C18:2) and linolenic (C18:3). 
Membrane lipids play an important role in cytoplasmic membrane permeability, it seemed probable that the damage of membrane during freeze-drying and during storage were caused by changes in lipid profile (Teixeira et al., 1996). Figure 8 shows the relation between changes in the unsaturated/saturated fatty acids and storage time. 

   

4°C

20°C

Figure 8. C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios of Pseudomonas fluorescens BTP1 powders during 90 days storage at 4°C or 20°C in vacuum-sealed aluminium foil 
The ratios of unsaturated to saturated fatty acids (C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0) for powder without glycerol at 4°C decrease respectively from 0.013 before storage to 0.002 after 90 days storage and 0.06 before storage to 0.001 after 90 days. At 20°C we have a decrease from 0.013 before storage to 0.001 after 90 days storage and 0.06 before storage to 0.0 after 90 days storage. This ratio indicates that freeze-drying and storage induces lesions in the cellular lipids (Coulibaly et al., 2009). These ratios (C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0) for the powder with glycerol at 4°C decrease respectively from 0.019 before storage to 0.004 after 90 days storage and 0.054 before storage to 0.036 after 90 days storage. At 20°C we have a decrease in the C18:2/C16:0 ratio from 0.019 before storage to 0.003 after 90 days storage and from 0.054 before storage to 0.017 after 90 days storage for the C18:3/C16:0 ratio. Comparing the ratios C18:2 and C18:3 by C16:0 of the powder with and without glycerol, it was observed that powder without glycerol is more affected by storage than cells with glycerol. 
Compared to the oxidation of lipids, glutathione are also oxidized. Glutathione was measured before and during storage. Glutathione (GSH) is the major cellular thiol participating in cellular redox reactions and thioether formation. Glutathione is a protective compound naturally produced by the cell; GSH is known to regulate many of the important functions of cells. The concentration of glutathione decrease during storage respectively at 4°C and 20°C for powder without glycerol; from 2.2 µmol/ g of powder before storage to 1.4 µmol/ g of powder and 0.6 µmol/ g of powder after 90 days storage. And for the powder with glycerol, we have a decrease from 2.2 µmol/ g powder before storage to 1.7 µmol/ g powder after 90 days storage at 4°C and a decrease from 2.2 µmol/ g powder before storage to 0.6 µmol/ g powder after 90 days storage at 20°C. This decrease of glutathione concentration is more pronounced for powder without glycerol than powder with glycerol, the fact that the concentration is lower at 20 ° C shows that the oxidation phenomena are marked at high storage temperature. Consumption of glutathione is evidence that some of the phenomena involved in P. fluorescens BTP1 death are oxidation phenomena.

Figure 9. Concentration of glutathione (GSH) in P. fluorescens BTP1freeze-drying during storage at 4 and 20°C (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)

Analysis by flow cytometry was used to assess the physiological state in which cells are at the end of freeze-drying. This technique allows the determination of relative percentages of viable cells, dead cells and intermediate cells (viable but non-cultivable) after double staining by the PI and cFDA (Miao et al., 2009). Figure 10 shows that for the cream before freeze-drying (control) we have 1.4% of dead cells, 4% of intermediate cells and 94.5% live cells, for powder without glycerol we have 44.9% of dead cells, 47.2% of intermediate cells and 7.9% of live cells and for powder with glycerol we have 36.1% of dead cells, 50.4% of intermediate cells and 13.5% of live cells. We found in our previous results that a majority of cells are in an intermediate state after 270 days storage at 20°C (Mputu Kanyinda et al., 2012b). 

Figure 10. Flow cytometry analyzed of Pseudomonas fluorescens BTP1 after PI/cFDA double staining (A.Cream of cells before freeze-drying, B. Powder with 2% glycerol, C. Powder without glycerol).

Compared with our present results (Mputu Kanyinda et al., 2012b) we observe that cells are more affected during freeze-drying than during storage and the best results are obtained by powder with glycerol. By comparing the results obtained from different powders with cream, we note that the freeze-drying affects considerably the cells.
5.	Conclusion
The results presented here provide experimental support to the hypothesis that P. fluorescens BTP1 is sensitive to freeze-drying, because gram negative not well adapted to desiccation by comparing with gram positive. Low viability during storage was associated with a decrease in C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios, more pronounced at 20°C. Glutathione consumption confirms its oxidation during storage and decrease of soluble protein concentration shows that proteins are altered during storage. These data further support the view that polyunsaturated fatty acids (linoleic and linolenic acids) and GSH play a key role in determining cellular susceptibility to oxidative. The beneficial effect to use glycerol is demonstrated by better viability, a low decrease of the ratios of unsaturated to saturated fatty acids (C18:3/C16:0 and C18:2/C16:0), a lower decrease of GSH during storage and a good percentage of living cells by flow cytometry after freeze-drying. The decrease in the ratio (C18:3/C16:0 and C18:2/C16:0) fatty acids, the consumption of glutathione and the decrease of soluble proteins proves that oxidation phenomenon is responsible for the mortality of P. fluorescens BTP1 during storage. The use of glycerol during freeze-drying step has resulted in improved viability.  This shows the beneficial effect to use glycerol in the conservation of P. fluorescens BTP1.
6.	Acknowledgements
Mputu Kanyinda Jean-Noel thanks to Belgium Technical Cooperation (BTC) and Walloon Region (CONSALIM project) for financial assistance.
7.	
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Conclusion du chapitre III
Les résultats qui viennent d’être présentés montrent l’impact du glycérol sur la protection de la membrane cellulaire de P. fluorescens BTP1 pendant la lyophilisation et au cours du stockage. Le glycérol permet d’obtenir une poudre présentant une meilleure survie après la lyophilisation et au cours du stockage tout en réduisant les phénomènes d’oxydation lipidique. Nous avons également démontré que l’oxydation lipidique était responsable de la dégradation des protéines qui se traduit par leur  insolubilisation et de l’oxydation du glutathion, tripeptide qui joue un rôle très important dans la protection de la cellule contre les stress oxydatifs. Enfin la cytométrie en flux nous a permis de comprendre que la perte élevée de viabilité observée chez P. fluorescens BTP1 était due à la lyophilisation et non à la conservation. Ces résultats sont importants pour le développement industriel de la production des poudres lyophilisées de P. fluorescens BTP1. 

Chapitres IV. Test accéléré de conservation de Pseudomonas fluorescens 

Introduction du chapitre IV
La conservation des poudres lyophilisées de Pseudomonas fluorescens demeure une étape très importante de la production, puisqu’elle est supposée maintenir une viabilité élevée sur une longue période. Ce chapitre porte sur le test accéléré de mortalité des poudres lyophilisées de P. fluorescens.  Ce test accéléré de mortalité doit permettre de déterminer les températures favorables à la conservation de P. fluorescens lyophilisé enfin de maintenir une viabilité élevée à la fin du stockage. Dans ce travail, nous utiliserons une souche de P. fluorescens mésophile (BTP1) du Centre Walloon de Biologie Industrielle  (CWBI) et deux souches thermophiles (PI9 et BB2) en provenance de la République d’Algérie.

Accelerated storage test of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains
Publication 4 – Afr. J. Biotechnol.
African Journal of Biotechnology.

Mputu Kanyinda Jean-Noël* (1,2), Destain Jacqueline (1), Noki Philippe (2), Thonart Philippe (1)
(1) Walloon Center of Industrial Biology, University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech, Passage   des déportés, 2-5030 Gembloux Belgium.
(²) Chemistry Department, Faculty of Sciences, University of Kinshasa, BP 190 Kin XI, Kinshasa/ DRCongo.

* Corresponding Author: Mputu Kanyinda Jean-Noël, Phone: +3281622305, Fax: +3281614222
E-mail:kanyinda2004@gmail.com 

Abstract

Freeze-dried cultures of P. fluorescens are used in agriculture and microbiological industry. However, P. fluorescens is very susceptible to damage during freeze-drying and subsequent storage and it would be useful to increase culture viability during storage. The viability of freeze-dried P. fluorescens strains (BTP1, PI9 and BB2) was evaluated by using the Arrhenius model. This model was described by measuring of reaction rate constants (D or k) and temperature sensitivity of rate constant (z or Ea). The freeze-dried P. fluorescens strains was stored in glass tubes at 60°C, 37°C and 4°C for 8 h, 28 days and 2 months, respectively. D value decreased or k increased with an increase of the storage temperature. By comparing their decimal reduction time (D), we observed that BB2 strain was more resistant than BTP1 and PI9 at 37 °C and 60 °C. The activation energy of all P. fluorescens strains are not significantly different and thermal inactivation may occur by the same mechanism. Thus it was possible to compare rate constants of survival for the freeze-dried P. fluorescens strains. These results will be useful to the development of improved reference materials and samples held in culture collections.

Keywords: Arrhenius model, accelerated storage testing (AST), freeze-drying, storage stability.

1.	
Introduction
Freeze drying is a more effective and gentle method to dry and preserve organisms, compared to e.g. spray drying or fluidizing. It involves freezing the sample and then removing the water under vacuum through sublimation (Portner et al., 2007). To develop this methodology further it is therefore important to identify potential hazards and to perform accurate quantitative assessments of constraints, eventually by using  probabilistic modelling approaches (Achour et al., 2001). 
Accelerated storage testing (AST) is a widely used method for the prediction of storage stability, storage quality and estimation of shelf-life of bacterial products (An-Erl King et al., 1998; Hernandez et al., 2009; Hernández et al., 2006). Such tests are performed by incubating the samples at temperatures higher than the usual storage temperature. Thus, data obtained under accelerated tests are used for performing extrapolation studies and prediction of the real-time behaviour. One disadvantage of this approach is that it considers only the assessment of viable cells, while the residual water content is omitted (Hernandez et al., 2009). The Arrhenius equation is the most common and generally valid assumption for the temperature-dependence of the deterioration rate. By means of the Arrhenius relationship, the stability of freeze-dried bacteria was successfully predicted using the accelerated storage test method (Ziadi et al., 2005; Yao et al., 2008; An-Erl King et al., 1998; Aguirre et al., 2009).
AST can be also used to study the stability of freeze-dried bacteria. Supportive work was reported by (Hernández et al., 2006; Achour et al., 2001; An-Erl King et al., 1998; Ziadi et al., 2005; Aguirre et al., 2009) who studied the effect of different temperature on the survival of Gram positive bacteria. The applicability of the Arrhenius method in studying and predicting the survival loss rate of the strains during storage may be applicable.

In this model, resistance to heat is described by two parameters: D and z. D is the time needed to reduce viable cell numbers by one log unit at a specified temperature, and z is the temperature change needed to bring about a tenfold change in D. Thermal inactivation of microorganisms may also be described by methods based on chemical reaction kinetics (Yao et al., 2008). 
The Arrhenius equation is usually employed describe the temperature dependence of the rate constant of inactivation (k), in which the key parameter is the activation energy (Ea). Using the Arrhenius model, it has shown that stability of freeze-dried lactic acid bacteria stored at low temperature may be quantitatively predicted on the results of short-term degradation studies at higher temperatures (Yao et al., 2008; Achour et al., 2001).
Furthermore, the physicochemical state of freeze-dried bacteria was well correlated to temperature (Hutchinson, 2004). However, z-value and Arrhenius models are useful aids in the evaluation of freeze-dried bacteria stability during storage (Achour et al., 2001; Tsen et al., 2007).
The aim of the present work was to study how temperature influences survival of P. fluorescens strains freeze-dried during storage by using the Arrhenius model. To do this, we subjected three freeze-dried P. fluorescens strains to mortality accelerated test to determine their decimal reduction time (D) and activation energy (Ea).
2.	Materials and methods
2.1 Strains and pre-culture conditions
The strains used in our study were P. fluorescens BTP1 of Walloon Center of Industrial Biology laboratory (CWBI) (Ongena, 1996; Mputu Kanyinda et al., 2012b) and P. fluorescens (PI9 and BB2) from Algeria to Saad Dahlab of Blida University. The King B agar (20 mg of casein peptone, 1.5 g of anhydrous K2HPO4, 1.5 g of MgSO4.H2O, 15 g of glycerol and 12 g of agar agar) was prepared for the maintenance of P. fluorescens strains. A colony from King B agar was inoculated into a pre-culture medium (King B liquid medium) in 250 ml Erlenmeyer flask. This pre-culture was incubated at 30°C for 24h and inoculated into à 5000 ml Erlenmeyer flask containing 3000 ml King B medium.
2.2 Production and freeze-drying
The strain was grown in 20 L bioreactor (Biolafite) containing 15 liters of King B medium, for 24 hours and then concentrated 20 times by centrifugation at 4000 rpm. The drying operation lasted approximately 46-48h including two main periods: freezing and sublimation. During freezing, the sample temperature decreased to a value of -25°C and then progressively increased back to 25°C at 0.9 mbar pressure. Cells were freeze-dried in a Low freeze-drier (LOUW KOELTECHNIEK BVBA) and stored in glass tube (Yao et al., 2008 ). 
2.3 Packaging and storage
Samples of the freeze-dried P. fluorescens were stored in glass tube at 60°C, 37°C and 4°C. For each temperature the dried samples (1 g) were rehydrated in 9 ml of peptone water solution, and sequential dilutions were prepared (Santivarangkna et al., 2007; Palmfeldt et al., 2003). The resulting colonies from samples taken during storage were counted on solid King B medium, and the number of viable cells was measured (Tsen et al., 2007).
2.4 Thermal treatment
Freeze-dried pellet was stored in glass tube for accelerated storage test at 60°C and 37°C. At 60°C, sample was removed at 2 h intervals for 10 h of exposure; at 37°C sample was removed at 7 days intervals for 28 days of exposure. Freeze-dried sample was also stored at 4°C to determine the number of viable cells each 15 days during 2 months.  Kinetics parameters (z-value, activation energy, decimal reduction time and the rate constant of temperature) were determined by the method as described by (Mottar, 1984; Yao et al., 2008; Hernandez et al., 2009). 
2.5 Kinetics parameters
For an irreversible first-order reaction at constant temperature, the time dependent kinetic parameter can be expressed as the D-value as followed:
                                                   (1)
The z-value represents a temperature range between which D value changes ten-folds and can be calculated from the D values as shown (1):
                                          (2)
The time dependent kinetic parameter can also be expressed as k, which is inversely related to the decimal reduction time (D) as followed:
                                                                (3)	
The rate constant of temperature can be expressed by the Arrhenius model:
                                                              (4)

Where:
k: the rate constant at the T temperature; k*: the pre-exponential term; Ea: the activation energy of the degradation reaction; R: the ideal gas constant. 
2.6 Statistical analysis
Data from three replications were analysed by using analysis of variance to determine if significant differences (P ≤ 0.05) existed between mean values. 
3.	Results and discussion 
The stability of freeze-dried bacteria largely depends on the storage temperature. In order to identify with time some parameters related to conservation of freeze-drying P. fluorescens strains, we used the Arrhenius theory and the value of z at 60, 37 and 4°C (Yao et al., 2008).  Viable cell counts in glass tubes stored at 60°C for 8 h declined too rapidly to be monitored, and demonstrated that P. fluorescens strains BTP1, BB2 and PI9 are very sensitive to elevated temperature. At 4 °C and 37 °C, P. fluorescens (BTP1, BB2, PI9) survived; with far the best survival at 4 °C. 

A

B

C

C

Figure 11. Thermal mortality curves of freeze-dried Pseudomonas fluorescens strains (A. BTP1, B. PI9, C. BB2) at ▲4°C, ● 37°C and ■ 60°C. Each point represents the mean of tree counts.
Figure 11 shows the thermal mortality curves of freeze-dried P. fluorescens BTP1 at 60, 37 and 4°C. At each storage temperature, linear regressions were conducted for Log10 (viability) in function of storage time according to Equation (1). E.g. P. fluorescens BTP1 decreased from 10.30 log10 to 4.5 log10 at 60°C after 8h storage; to 5.7 log10 after 28 days storage at 37°C and to 9.2 log10 after 60 days storage at 4 °C. The present results basically confirm literature data (An-Erl King et al., 1998; Ziadi et al., 2005; Achour et al., 2001; Picot and Lacroix, 2003). Strain BB2 performs better than BTP1 and PI9 at 37 °C and 60 °C. Some work has demonstrated, that experimental determination of bacterial survival at higher temperatures can be successfully used to predict bacterial survival for lower temperature (Ziadi et al., 2005; Achour et al., 2001; Yao et al., 2008; Hernández et al., 2006). 

Figure 12. Determination of activation energy (Ea) of freeze-drier Pseudomonas fluorescens strains (♦: BTP1, ■: BB2, ▲: PI9)

Figure 12 shows the survival rate curves of P. fluorescens strains. The data obtained were used to calculate decimal reduction times (D), inactivation constant (k), activation energy and value of thermal resistance (z) according to equations (2 to 4). z is the change in temperature required to obtain a tenfold increase or decrease to a tenth of the value D, for our strains (BTP1, BB2, PI9) z value obtained are respectively 32.04 ±1.1°C, 27.10 ±1.3°C and 49.3 ±3.5°C.The activation energy values (Kj/mol) for the degradation process of the powders stored at glass tube are 6.1 for BTP1, 8.4 for BB2 and 7.0 for PI9. 

Table 6. Decimal reduction time (D) or rate constant (k) for freeze-dried P. fluorescens strains.
P. fluorescens strains	Storage (°C)	D (h)	k (S-1)	Ea (kjmol-1)	z (°C)	
	4	1200	0.0019			
BTP1	37	56	0.021	6.1	32.0±1.1	
	60	1.4	1.67			
	4	1000	0.0023			
PI9	37	64	0.036	7.0	49.3±3.5	
	60	1.4	1.69			
	4	3000	0.0008			
BB2	37	109.3	0.021	8.4	27.1±1.3	
	60	1.3	1.3			

The kinetic parameters k and D calculated from equations (1) and (4), respectively show that the decrease in decimal reduction time (D) or the increase of k temperature dependent (Yao et al., 2008). The Ea and z value are inter-related. D and z values were experimentally obtained Table 1and used to design the heat treatments in order to obtain several inactivation intensities. Increasing the storage temperature causes an increase in cell death, and this shows that the freeze-dried powders of P .fluorescens strains does not keep viability for very long time during storage at temperatures above 30°C.
4.	Conclusion
Freeze-drying is a useful technology for drying P. fluorescens strains; our results demonstrated that the z-value or Arrhenius models could be used to predict storage stability of freeze-dried P. fluorescens at various temperatures. The R² value (Fig.12) close to unity is an indication of the applicability of the Arrhenius law, indicating an exponential effect of the storage temperature on the survival rate loss of the studying and predicting the survival rate loss of the strains during storage. Storage temperature at 60°C had a destructive effect on the viability of the freeze-dried bacteria of all three tested strains.
5.	Acknowledgment
Thanks to Belgium Technical Cooperation (BTC) for financial assistance.
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Conclusion du chapitre IV
Nos résultats obtenus en utilisant le modèle d’Arrhenius permettent de prédire la stabilité au stockage des poudres lyophilisées de Pseudomonas fluorescens à différentes températures. Avec une valeur de R² proche de l’unité, celle-ci indique l’applicabilité de la théorie d’Arrhenius. Comme l’on pouvais s’y attendre, les souches thermophiles de Pseudomonas fluorescens (BB2 et PI9) ont montré une stabilité beaucoup plus grande que la souche mésophile (BTP1) à 37 et 60°C. Mais la température de stockage de 60°C a un effet destructeur sur la viabilité des Pseudomonas fluorescens lyophilisés. Nous pouvons donc conclure que la viabilité de Pseudomonas fluorescens lyophilisés est liée aux conditions de stockage.

Chapitre V. Test accéléré d’oxydation de Pseudomonas fluorescens

Introduction du chapitre V
La lyophilisation rend vulnérable la poudre des bactéries aux attaques des espèces réactives d’oxygène au cours du stockage. Les lipides sont des cibles majeurs au cours du stress oxydant, car les radicaux libres attaques directement les acides gras poly-insaturés. Dans ce chapitre, nous avons soumis les poudres lyophilisées de Pseudomonas fluorescens à l’oxygène singulet produit par photosensibilisation du bleu de méthylène à la lumière U.V. Ce test accéléré de l’oxydation permettra de consolider notre hypothèse selon laquelle l’oxygène est en partie responsable de la mortalité des poudres lyophilisées mais aussi d’envisager un moyen efficace de limiter sa présence. Comme pour le test accéléré de mortalité, nous avons utilisé trois souches de P. fluorescens (BB2, BTP1 et PI9).

Accelerated oxidation test of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1, BB2 and PI9 strains
                                      Publication 5 – Inter. J. Microbiol. Res.
International Journal of Microbiology Research.

Mputu Kanyinda Jean-Noël1,2*, Ben Oussaid Nacera3, Lusamba Vinhy², Noki Philippe², Destain Jacqueline1, Thonart Philippe,1 Delvigne Frank.1

1Walloon Center for Industrial Biology (CWBI), Bio-Industry Unit, University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech, Passage des Déportés, 2-5030 Gembloux Belgium
²Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Kinshasa, BP 190 Kin XI, DR Congo
3Faculty of Agro-Vets and Biological, Saad Dahlab of Blida University, B.P 270 Blida Algeria

* Corresponding Author: Mputu Kanyinda Jean-Noël, Phone: +3281622305, Fax: +3281614222
   E-mail:kanyinda2004@gmail.com 
Abstract
Pseudomonas fluorescens strains are very susceptible to damage during freeze-drying and storage. It would be useful to have longer lasting viable powders. Membrane oxidation is one of the factors responsible for damages suffered by P. fluorescens strains during storage. Singlet oxygen (1O2) is a highly reactive form of molecular oxygen that may harm living systems by oxidizing critical cellular macromolecules. We exposed freeze-dried powders of three strains P. fluorescens (BB2, BTP1 and PI9) to singlet oxygen produced by photosensitisation of Methylene Blue/ light during 2 hours. We observe a significant loss in survival rate, a pronounced oxidation of polyunsaturated fatty acids, protein oxidation (carbonyl groups) and protein insolubilisation. This study enables better predictions of types of packaging suitable for freeze-dried powders of P. fluorescens.
 Key words: Accelerated oxidation test (AOT), carbonyl group, freeze-drying, Oxygen singlet, Pseudomonas fluorescens.

1.	Introduction
Freeze-dried P. fluorescens is usually used in agriculture and in the microbiological industry, but it very susceptible to damage during freeze-drying and subsequent storage and it would be useful to have longer-lasting cultures (Mputu Kanyinda et al., 2012b). However, freeze-drying also renders the powder vulnerable to Reactive Oxygen Species (ROS) attack during storage (Coulibaly et al., 2011; Mputu Kanyinda et al., 2012a). Lipids are major targets during oxidative stress. Free radicals can directly attack polyunsaturated fatty acids in membranes and initiate lipid peroxidation (Coulibaly et al., 2011). These highly reactive free radicals can oxidize lipids, proteins and DNA, contributing to a variety of important types of cellular damage. In biological membranes, lipid peroxidation is frequently a consequence of free radical attack (Yoon et al., 2002; Cabiscol et al., 2000). A primary effect of lipid peroxidation is a decrease in membrane fluidity, which alters membrane properties and can disrupt membrane-bound proteins significantly. This effect acts as an amplifier in which more radicals are formed and polyunsaturated fatty acids are degraded into a variety of products. Some of these, such as aldehydes, are very reactive and can in turn damage other molecules such as proteins (Yoon et al., 2002; Fleming et al., 1982). The main protein modifications observed are: loss of catalytic activity, amino acid modifications, carbonyl group formation, decreases in thermal stability, changes in viscosity, changes in fluorescence, fragmentation, formation of protein-protein cross-links, formation of disulfide bridges, and increased susceptibility to proteolysis (Cabiscol et al., 2000). Subsequent to the finding that some amino acid residues (including lysine, arginine, proline and threonine) can be oxidized to carbonyl derivatives (Berlett and Stadtman, 1997), several methods to detect the carbonyl content of proteins were developed and used to measure protein damage (Levine, 2002).
The aim of this work is to determine the damage caused by ROS on freeze-dried powders of three P. fluorescens strains. To do this, freeze-dried P. fluorescens powders were exposed to singlet oxygen produced by the action of light on Methylene Blue (MB/ light). In this paper, we examined overall viability as well as specific oxidative damage to fatty acids, proteins and DNA in freeze-dried P. fluorescens powders after exposure to Methylene Blue/light.
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and cultivation
The strain used in our study is P. fluorescens BTP1 from the Walloon Center of Industrial Biology laboratory (CWBI), P. fluorescens BB2 and PI9 from Faculty of Agro-Vets and Biological ,Saad Dahlab of Blida University Algeria (Mputu Kanyinda et al., 2013). The strain was grown in a 20 L bioreactor (Biolafitte) containing 16 L of 863 medium for 20 hours and then concentrated 20-fold by centrifugation (Sorval RC 12 BP) at 4700 rpm. Afterward, the pellets were dried in a freeze-drier (LOUW KOELTECHNIEK BVBA) using a standard program in which the temperature was gradually increased from -25°C to 25°C at 0.9 mbar pressure during 48 hours (Mputu Kanyinda et al., 2012b).
2.2 Photosensitisation 
Samples were exposed to 40 µM of Methylene Blue (MB) in the presence of light. Methylene Blue produces singlet oxygen when exposed to an incandescent bulb (Yoon et al., 2002).
2.3 Water activity (aw) and survival rate
The water activity (aw) of freeze-dried samples was measured at 25°C using a water activity meter (Gbx-meter, Paris, France). Standard salt solutions (Gbx) of known water activity were used for calibration of the sensor at the measuring temperature. Percentage survival of strains during exposure was expressed as follows: 
Survival (%) = , where N0 is the CFU/g of the sample at the end of freeze-drying and N is the CFU/g of the freeze-dried sample at a given time. Each result was the geometrical mean of at least three counts (Coulibaly et al., 2009). 
2.4 Protein carbonyl content
The protein carbonyl content was determined spectrophotometrically using the described 2,4-dinitrophenyl hydrazine (DNPH) labelling procedure of (Levine, 2002) with modifications. Cells were lysed by sonication and collected by centrifugation (1500 rpm, 10 min at 4°C). Each sample (0.2 ml) was then incubated with 0.8 ml 0.2% DNPH in 2.5 M HCl for 1 h at room temperature. The protein hydrazone derivatives were sequentially extracted with 10% (w/v) trichloroacetic acid, treated with ethanol/ ethyl acetate, 1:1 (v/v), and re-extracted with 10% trichloroacetic acid. The resulting precipitate was dissolved in 6 M guanidine hydrochloride. A blank was run through a parallel procedure with 2 M HCl alone instead of the DNPH reagent. Results are expressed as nmol/ carbonyl/ mg of protein as determined by absorption at 360 nm (Kim et al., 2002; Luqman and Rizvi, 2006).
2.5 Fatty acid analysis by gas-liquid chromatography
Total lipids were extracted overnight from dried cells (1 g) with a chloroform-methanol (2:1 v/v) mixture. Saline solution (0.88% (w/v)) was added in order to obtain 2 phases and shaken overnight using a modified Folch method (Mputu Kanyinda et al., 2012a). The lower organic phase contains all lipids except gangliosides. The chloroform-methanol extracts were pooled, filtered, and then evaporated and concentrated under reduced pressure at 35°C. Fatty acid methyl esters (FAME) were prepared from the concentrate with a 14% (w/w) solution of boron trifluoride (BF3) in methanol as reagent (Sigma, St Louis, MO, USA). After heating at 70 °C in a water bath for 90 min, 0.5 ml of saturated NaCl, 0.2 ml of sulphuric acid (10%) and 0.5 ml of n-hexane were added. The methylated fatty acids were taken from the upper phase after decanting. Gas chromatographic analysis of the methyl esters was carried out on an HP 6890 (Hewlett Packard) gas chromatograph equipped with a flame ionization detector at 250 °C (Coulibaly et al., 2009; Mputu Kanyinda et al., 2012b). A capillary column (30 x 0.25 mm) was used. Helium was used as the carrier gas (2.4 ml/minute) and the injection volume was 1 µl. Injection was done at 250 °C in splitless mode for 1 min. The oven temperature was held at 50 °C for 1 min, then increased by 30 °C/min to 150 °C, and then from 150 °C to 240 °C at 4 °C/min with a final hold of 10 min at 240 °C. Fatty acid methyl esters were identified by comparing their retention times with a standard mixture FAME MIX 47885U (Supelco, Bellefonte, USA). The relative fatty acid content was estimated as a percentage of the total peak area using a DP 700 integrator. The relative content (%) of each fatty acid was normalized by expressing it as a ratio of the relative content (%) of palmitic (C16:0) acid for two reasons: [1] C16:0 had the highest proportion at most points relative to other fatty acids, [2] C16:0 did not change significantly during storage (p>0.05) (data not shown) (Coulibaly et al., 2010).
2.6 Soluble proteins
One gram of P. fluorescens BTP1 powder was washed twice by centrifugation (14000 g, 30 minutes at 4°C) in 10 ml of Tris 50mM, pH 8.8. The cells were then lysed for 3 minutes by sonication (Bandelin Sonoplus HD 2070) in Tris-EDTA (50 mM, pH 8.8). After sonication, centrifugation was performed (24,000 g, 15 minutes at 4°C) to remove cells and crushed cellular debris. The supernatant containing soluble proteins was assayed with the Bicinchoninic Acid Protein Assay kit from Sigma (Brown et al., 1989; Chart, 1995).
2.7 Statistical analysis
Data from three replications were analyzed by using analysis of variance to determine if significant difference (P≤0.05) existed between mean values (origin 6.1 system function). 
3.	Results 
Figures 13 to 16 show the respective evolution in survival rates, membrane fatty acid composition, soluble protein and carbonyl groups in the different powders during exposure to methylene blue. 

Figure 13. Effect of MB/light on viability of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) over 90 minutes.

Figure 13 shows the percentage surviving for the three P. fluorescens strains. During 90 minutes exposure to Methylene Blue /light, we observed a pronounced decrease in the survival rate after 30 minutes of exposure. 

PI9

Figure 14. Fatty acids evolution after P. fluorescens exposure to Methylene Blue/ light
As seen in figure 14, we observed a strong decrease in polyunsaturated fatty acids (C18: 2 and C18: 3) during the exposure. 

Figure 15. Protein content of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) during a 90 minute exposure to 25 mM MB/ light

Figure 16. Protein carbonyl content of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) during a 90 minute exposure to 25 mM MB/ light

Figures 15 and 16 show changes in the concentrations of soluble proteins and carbonyl groups, which are indicators of protein oxidation, we observed a protein insolubilisation during exposure and increased concentration of carbonyl group, demonstrating the presence of oxidative phenomena. 
4.	Discussion
In a previous work (Mputu Kanyinda et al., 2012a) P. fluorescens were produced in a 100 L bioreactor, with or without the addition of cryoprotector (2% glycerol) and freeze-dried. The storage stability of the freeze-dried samples was then studied by monitoring several parameters such as: loss in viability, protein insolubilisation and changes in membrane structure (precisely C18:2 and C18:3). To be able to improve long term storage of bacteria requires knowledge of the phenomena such as oxidation (lipid, proteins and DNA) responsible for sample degradation over time (Coulibaly et al., 2011). We know that 1O2 can be generated in cells, such as under conditions of oxidative stress, decomposition of lipid peroxides, or by spontaneous dismutation of superoxide (Sies, 1986). In our study, three strains of P. fluorescens were used: a psychrophilic strain, P. fluorescens BTP1, from the Walloon Center of Industrial Biology (CWBI) and thermophilic , BB2 and PI9, sent from Algeria to Saad Dahlab of Blida University (Mputu Kanyinda et al., 2013). After freeze-drying, the powders were conditioned in glass tubes for an accelerated oxidation test. The accelerated oxidation test was monitored by losses in cell viability, changes in carbonyl groups, protein concentration, DNA oxidation and lipid oxidation (by profiling fatty acids) during a 90 minute exposure of the powders to Methylene Blue/ light. The activity water (aw) of all powders was measured before exposure and samples were taken every 30 minutes during exposure for analysis. The water activity of all powders was high; e.g., 0.33 for the BTP1 strain 0.29 for the PI9 strain and 0.39 for the BB2 strain. 
The percentage of survivors is expressed by logarithmic values of the surviving fractions after 90 minutes exposure. We observe that the PI9 strain shows a higher survival rate after exposure than the BTP1 and BB2 strains. The decrease in survival rate observed after 30 minutes exposure to Methylene Blue/light is more pronounced for the BB2 strain (25%) compared to BTP1 and PI9 (60%), but after 60 minutes exposure the decrease is more pronounced with all strains. This shows that the singlet oxygen produced has a considerable impact on the viability of the freeze-dried powders. Lipids are also affected by this exposure; as with survival rates, levels of polyunsaturated fatty acids (C18:2 and C18:3) also decrease. This decrease is more pronounced with the BB2 strain, which has a greater value of water activity (figure 14). Of all the strains, P. fluorescens BTP1 from the Walloon Center of Bio-Industry showed a lower percentage of polyunsaturated fatty acids (C18:2 and C18:3) (Mputu Kanyinda et al., 2012b) than BB2 and PI9 from the Algerian Republic. Lipid oxidation of membrane fatty acids has been deemed responsible for cell death during storage (Teixeira et al., 1996; Coulibaly et al., 2009). The main relative percentages from all the strains before or after exposure are presented in figure 14. This decrease shows that our three strains are very sensitive to Methylene Blue /light exposure. Protein oxidation mediated by reactive oxygen species is accompanied by the conversion of proline, lysine, arginine and histidine residues into carbonyl derivatives, thereby providing a convenient assay for oxidative modification (Luqman and Rizvi, 2006). 
As shown in figure 15 and figure 16 protein oxidation and protein insolubilisation were significantly increased in three strains during exposure to Methylene Blue /light. However, the BB2 strain showed significantly higher levels of carbonyl groups and protein concentration compared to the BTP1 and PI9 strains during this exposure.  Oxidative damage to membranes results in increased membrane fluidity, compromised integrity, and inactivation of membrane-bound receptors and enzymes (Luqman and Rizvi, 2006). The decrease in protein concentration shows that proteins are being altered and insolubilized by the oxygen singlet produced by exposure to Methylene Blue/ light. Protein denatured is also pronounced after 30 minutes exposure, reflected in the decreased concentrations of soluble proteins. This decrease is more pronounced for the BB2 strain but it is still constant after 30 minutes for the BTP1 and PI9 strains. Carbonyl groups increase more for BB2 strain after a 30 minute exposure, whereas most of the increase for BTP1 and PI9 began after 60 minutes. This shows that the BB2 strain is the first strain to undergo protein oxidation, and in fact BB2 has a high water activity.
5.	Conclusion 
The results presented here provide experimental support for the hypothesis that Oxygen is one key element responsible for the mortality of P. fluorescens during storage of the freeze-dried powder. These results indicate that water activity and lipid peroxidation represent important intermediary steps in the process of oxygen radical-induced genetic damage during storage of the powder. This test allows us to understand the mechanisms responsible for loss of viability in freeze-dried powders during storage. Our results show that exposure of powders to singlet oxygen produced by photosensitisation with Methylene Blue /light (MB/light), leads to membrane oxidation. This oxidation is responsible for the loss in viability during storage of freeze-dried bacteria powders.
6.	Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Walloon Region (Consalim) for assistant aids. We thank all the technical personals of CWBI (Centre Wallon de Biologie Industrielle). We also express our gratitude to Communauté Francaise de Belgique for its financial assistance.
7.	References
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Conclusion du chapitre V
Les résultats présentés dans ce chapitre mettent en relation le phénomène d’oxydation avec les paramètres physiologiques (composition en acides gras et le contenu en protéines). Durant l’exposition de nos poudres lyophilisées à l’oxygène singulet, nous avons observé une diminution de la viabilité, accompagnée d’une oxydation des acides gras poly-insaturés, d’une oxydation et d’une insolubilisation des  protéines. Ces résultats montrent que les poudres de souches thermophiles (BB2 et PI9) s’oxydent après l’oxydation de la souche mésophile (BTP1). Ceci vient confirmer l’hypothèse selon laquelle l’oxygène est en partie responsable de la mortalité cellulaire au cours du stockage des poudres lyophilisées de P. fluorescens. Un conditionnement sous vide et dans un emballage imperméable à la lumière et à l’oxygène permettra de maintenir cette viabilité durant une longue période de conservation.

Chapitre VI. Optimisation de la production de Pseudomonas fluorescens BTP1 en fermenteur

Introduction du chapitre VI
L’étape de la production de Pseudomonas fluorescens BTP1 est très importante pour garantir un produit final de qualité supérieure. La maitrise des paramètres de la fermentation détermine la qualité de la poudre obtenue. Souvent produit en 24h en culture submergée dans un fermenteur, l’objectif poursuivi dans ce chapitre est d’améliorer le rendement et la qualité du produit (la viabilité). La baisse de l’activité d’eau aw, de l’humidité relative et le conditionnement sous vide dans un emballage imperméable à l’oxygène et à la lumière doivent permettre une bonne conservation de P. fluorescens BTP1. La viabilité de nos poudres lyophilisées avec ou sans composés protecteurs seront étudiées au cours du stockage à 4 et 20°C. Ces résultats permettront aux industriels d’avoir les outils nécessaires pour la production et la conservation de P. fluorescens BTP1 lyophilisée.

Optimisation of production, freeze-drying and storage of Pseudomonas fluorescens BTP1
Publication 6 – Inter. J. Microbiol. Res.
International Journal of Microbiology Research.

Mputu Kanyinda Jean-Noel1,2* and Thonart Philippe1.
1Walloon Center for Industrial Biology (CWBI), Bio-Industry Unit, University of Liege Gembloux Agro-Bio Tech, Passage des Déportés, 2-5030 Gembloux Belgium
² Department of Chemistry, Faculty of Sciences, University of Kinshasa, BP 190 Kin XI, DR Congo

  

  *Corresponding author: Tel.+32.81.62.23.05, Fax.+32.81.61.42.22 E-mail: kanyinda2004@gmail.com.

Abstract

The optimisation of production and freeze-drying of P. fluorescens used as a bio-control agent was investigated. P. fluorescens BTP1 was produced in a bioreactor with different back pressure value (0.1 and 0.3 bar for bioreactor 1 and 2 respectively) and cells were harvested during the stationary phase (2 h and 4 h for bioreactor 1 and 2 respectively). A mixture of protective compounds was tested for freeze-drying, and the highest result was found for glycerol and maltodextrin (26%) followed by glycerol, maltodextrin and ascorbic acid (18.9%) and glycerol with ascorbic acid (8.5%). We observed that the survival rate is better at 4°C than at room temperature and those powders with protective compounds have a survival rate greater than the powder without protective compounds during storage.

Key words: Bioreactor, freeze-drying, optimisation, protective compound, water activity.

1.	Introduction
Freeze-drying is a commonly used method to preserve bacteria in research as well as in industry. Freeze-drying is a technique suitable for production of concentrated bacterial cultures with the advantage that the dried material can be stored at ambient temperature and easily transported (Palmfeldt et al., 2003; Coulibaly et al., 2009; Mputu Kanyinda et al., 2012b; Morgan et al., 2006; Louis et al., 1994). However, freeze-drying brings about undesirable side effects, such as modifications in the physical state of membrane lipids and altered proteins, causing the loss of cell viability during the process as well as during subsequent storage (Mputu Kanyinda et al., 2012a). Lipid oxidation of membrane cells was deemed responsible for cell death during freeze-drying and during storage (Garait et al., 2005; Nanasombat and Sriwong, 2007; Mputu Kanyinda et al., 2012a). The knowledge and control of some parameters in the production of P. fluorescens in bioreactor allows cells to survive during freeze-drying (Slininger et al., 1996). 
Different physiological states are obtained by harvesting the cells in different growth phases or by transiently creating non-optimal growth conditions. Freeze-drying survival is commonly found to be higher for stationary-phase cells than for exponentially growing cells. The stationary phase, induced by carbon starvation, triggers a general stress response, which involves induction of a wide range of stress proteins (Palmfeldt and Hahn-Hagerdal, 2000; Palmfeldt et al., 2003). The conditioning freeze-dried powder under vacuum in packaging light-tight and water vapor, increases the storage time (Béal et al., 2001). As well as protective compounds, growing conditions also influence the resulting viability after freeze-drying (Abadias et al., 2001). Another important parameter affecting the stability of the product is the value of the water activity (aw) (Coulibaly et al., 2011). This value depends on parameters of the drying process (e.g. time) and can be adjusted to a certain degree after freeze-drying. At high aw values, the dry cell can be destroyed because solutes can diffuse in water and therefore damage the cell by an osmotic effect (Béal et al., 2001).
The aim of this study was to investigate the effect of different growth conditions, different protective compounds on P. fluorescens BTP1 and influence of the storage temperature. 
2.	Materials and methods
2.1 Organisms and growth
P. fluorescens BTP1 used in our study was from the Walloon Center of Industrial Biology laboratory (CWBI) (Ongena et al., 1999). P. fluorescens was cultivated in 863 medium at 30°C. Pre-cultures of 100 ml were grown for 24 h in an Erlenmeyer flask at 150 rpm in a rotary shaker. The pre-culture was inoculated into 5-L Erlenmeyer flasks containing 3 L of 863 medium, and grown for 24 h at 30°C and 150 rpm in a rotary shaker before bioreactor inoculation. The bioreactor (Biolafitte, France) had a working volume of 250 L and was equipped with an electrical heating jacket and temperature sensors. Aeration was carried out by sparging with air at an initial gas flow of 1 vvm (Yao et al., 2009). Air saturation was controlled by automatic regulation of the stirring speed, which was in the range 100–150 rpm, depending on the oxygen consumption rate. The pH was maintained at ~7 by the addition of 14% KOH solution. Cell growth was monitored as optical density (OD) at 540 nm with a spectrophotometer (V-1200) and the cultivation time was 16 hours. Cells were harvested by centrifugation (7000xg, 20 minutes at 4°C).
2.2 Preparation of freeze-drying
Cells were harvested in the stationary phase of growth by centrifugation (7000xg, 20 minutes, 4°C). After centrifugation, pellets were divided into three parts: two with protective compounds (1 or 2% w/w glycerol, 5 or 10% maltodextrin and 0.1% of ascorbic acid) and one without protective compounds (Coulibaly et al., 2009; Mputu Kanyinda et al., 2012b). Protective solution where sterilised at 121°C for 10 minutes before mixing. Then samples were placed in the freezer for 24 h and the frozen samples were freeze-dried for 72 h in a freeze-drier (LOUW KOELTECHNIEK BVBA) with a standard program. The time for primary drying was about 6 h, the condenser temperature -45°C and the final sample temperature was 25°C by increasing the temperature gradually from -45°C to 25°C at 0.9 mbar pressure (Jørgensen et al., 1994; Yao et al., 2010). For storage tests, samples were sealed under vacuum in aluminium sachets and stored at 4 or 20°C
2.3 Measurement of cultivability and water activity (aw)
The number of viable cells during growth, before freezing, after freeze-drying and during storage was determined as colony forming units (CFU). Samples were rehydrated by the addition of 9 ml peptone water and 100 µl was thereafter plated on plate counts agar (PCA). After serial dilutions in peptone water, cells were plated onto solid 868 agar and incubated at 30°C for 24 h. The number of colonies was counted after 24 h incubation and survival rate was expressed as the ratio of colony-forming units per mg or ml after freeze-drying (Nf) and before freeze-drying (N0). Viability (%) = (Nf/N0) x 100. Water activity was measured by a water activity meter Gbx, each result was the geometrical mean of at least three counts (Coulibaly et al., 2009). 
2.4 Statistical analysis
Data from three replicates were analysed by using analysis of variance to determine if significant differences (P≤0.05) existed between mean values (origin 6.1 system function). 
3.	Results 
Bioreactor growth
In this work, P. fluorescens BTP1 is produced in two bioreactors with the same process conditions (pH, temperature, stir and volume). The only major differences between the two bioreactors are: the time of harvest the cell biomass and the back pressure. In the first bioreactor, the back pressure is 0.1 bar while in the second bioreactor, the back pressure is 0.3 bar as shown in Table 7. 
Table 7. Different parameters of the production in bioreactor of Pseudomonas fluorescens BTP1. 
 
                      Bioreactor 1	                         Bioreactor 2	
 pO2	    pH	T(°C)	    ΔP	 pO2	      pH	  T(°C)	      ΔP	
1 vvm	7.0±0.3	30±2 	 0.1bar	1vvm	7.0±0.3	30±2	    0.3bar	

In the first bioreactor, cells were harvested 4 h after beginning of the stationary phase while in the second bioreactor; cells were harvested 2 h after the stationary phase. The consumption of KOH and oxygen during cell growth, optical density evolution and viability during growth is shown in figure 17 for the first bioreactor and in figure 18 for the second bioreactor.

Figure 17. Evolution of viability, optical density, oxygen and base (KOH) during the production of Pseudomonas fluorescens BTP1 in the first bioreactor.

Figure 18. Evolution of viability, optical density, oxygen and base (KOH) during the production of Pseudomonas fluorescens BTP1 in the second bioreactor.

Freeze-drying
The freeze-dried powders without protective compounds have a high mortality rate at the end of the freeze-drying, 1% for the powder obtained in the first bioreactor and 2% for the second bioreactor. Cells were freeze-dried with different formulation of protective compounds. After freeze-drying, survival rate, dry matter and water activity were measured (Table 8). 
Table 8. Percentage of survival, water activity and dry matter of different combinations of protective compounds after freeze-drying.
Bioreactor 1	Bioreactor 2	
 Sample	    D.M	      aw	survival	  Sample	   D.M	        aw	 survival	
  P1	92.8±0.6	0.27±0.03	 18.9%	    S1	93.4±0.2	 0.23±0.02	  26%	
  P2	84.8±0.1	0.26±0.01	 8.5%	    S2	95.0±0.2	 0.29±0.02	  2%	
  P3	95.5±0.1	0.33±0.02	 1.0%	     -    	       -	   -	   -	

Cells harvested in the first bioreactor, were divided into three parts: we have P1 (cell with 2% glycerol, 5% maltodextrin and 0.2% ascorbic acid), P2 (cell with 2% glycerol and 0.2% ascorbic acid); and P3 (cell without protective compounds). 
Storage test
The freeze-dried powders were stored in aluminum packets under vacuum and stored at 4°C and at room temperature during 90 days. The water activity (aw) was measured before vacuum packaging of powders and the dry matter was measured directly after freeze-drying (Table 8). Figures 19 and 20 shows the evolution of survival rates of freeze-dried powders stored 90 days at 4°C and at room temperature for the bioreactor 1; whereas the results for powders obtained in the second bioreactor are shown in figures 21 and 22.

Figure 19. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP during storage at 4°C in aluminum bag under vacuum with and without protectors

Figure 20. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP 1 during storage at room temperature in aluminum bag under vacuum with and without protectors

Figure 21. Loss in survival of freeze-dried P. fluorescens BTP during storage at 4°C in aluminum bag under vacuum with and without protectors

Figure 22. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas  fluorescens BTP during storage at room temperature in aluminum bag under vacuum with and without protectors

4.	
Discussion 
The inoculums of these two bioreactors were done under the same operating conditions (culture time, temperature, agitation and composition of the culture medium). After 24 h of growth, optical densities (OD540 nm) of our inoculums were respectively 5.4 and 6.3 for the first and second bioreactor. After inoculation, the following parameters were monitored during production: temperature maintained at 30°C, pH maintained at ~7 by adding 14% KOH solution. The only major difference between the two bioreactors was the back pressure (0.1 bar in the first bioreactor and 0.3 bar in the second) (Table 7). By comparing the two bioreactors we observe that the consumption of KOH to maintain pH at ~7 and oxygen were almost identical during production. The only difference is observed in bacterial growth. In the first bioreactor, the stationary phase started after 16 h of culture and the cell concentration at the end is 6.3x109 CFU/ml (figure 19), while in the second bioreactor, the stationary phase occurred after 12 h of culture and cell concentration at the end is 1.3x1011 CFU/ml (figure 20).
Freezing step is part of the freeze-drying procedure (Perry, 1998), samples were frozen for 24 hours in a freezer before freeze-drying. The pellet was divided into two parts, one with protective compounds and another without protective compounds. Our results show that powders with protective compounds have a higher survival rate than powders without protective compounds. The survival rate for P1 (powder with 2% glycerol, 5% maltodextrin and 0.2% ascorbic acid) was 18.9%, 8.5% for P2 (powder with 2% glycerol and 0.2% ascorbic acid) and 26% for S1 (powder with 1% glycerol and 10% maltodextrin). The powders without protective compounds (P3, S2) each have a survival rate of 1 to 2% after freeze-drying (Table 8). Similar results were found previously (Mputu Kanyinda et al., 2012a; Mputu Kanyinda et al., 2012b; Palmfeldt et al., 2003; Saarela et al., 2005). By comparing powders with protective compounds, we observe that S1 gives a higher survival rate and dry matter than P1 and P2 samples. The difference in survival rate of the different powders can be explained by the concentration of protective compounds and by the cell concentration before freeze-drying (1.6x1010 CFU/g for the first bioreactor and 1.03x1011 CFU/g for the second) (Palmfeldt et al., 2003). The European Patent No. EP 1234019 B1 published in august 28, 2002 reports that the water activity reflects the degree of freedom of the water in the product concerned and has a strong impact on the stability and preservation during storage of this product. After freeze-drying, powders with and without protective compounds were sealed in aluminum bags under vacuum and stored at 4°C or at room temperature. The survival rates of powders without protective compounds P3 and S2 decrease during storage at 4°C or at room temperature, but this decrease is most pronounced at room temperature. Example for P3 survival rate is 15% at 4°C and 1.1% at room temperature and for S2, the survival rate at 4°C is 18% and 1% at room temperature. The highest survival rates were observed at 4°C 59% for P1, 51% and 56% for P2 and S3 respectively. The international patent WO 03/018778 published August 30, 2001 confirm that more the storage temperature is low, best is storage. And the conditioning freeze-dried powder under vacuum in light-tight packaging and water vapor increases the storage time. Our results show that glycerol and maltodextrin have a strong protective effect upon the survival P. fluorescence during freeze-drying, and similar results were found in our previous study (Mputu Kanyinda et al., 2012b; Stephan et al., 2007). However, industrially used bacteria, such as lactic acid bacteria, typically show survival values above 50% when dried in the presence of a protective compound (Palmfeldt and Hahn-Hagerdal, 2000) and above 1% when dried in the absence of protective compounds (Leslie et al., 1995). The survival values of 26% in the presence of a protective compound and below 2% in its absence show that P. fluorescens is rather sensitive to freeze-drying; similar results were found for P. chlororaphis (Palmfeldt et al., 2003).
5.	Conclusion
In conclusion, the present study shows that carbon starvation, growth time, freeze-drying, protective compounds and the initial cell concentration contributes to enhanced freeze-drying survival and if one of them is suboptimal the survival decreases. These results show that the survival rate is better at 4°C than at room temperature and that powders with protective compounds (P1 and P2) have a survival rate greater than the powder without protective compounds (P3) during storage. For the second bioreactor, the survival rate for the different powders (S1 and S2) was better at 4°C than at room temperature. The powder with protective compounds (S1) had a greater survival rate than the powder without protective compounds during storage at 4°C and at room temperature. It would also be important to study the stability of freeze-dried P. fluorescens bacteria. These findings are necessary for the industrial development of the starter culture formulation.
6.	Acknowledgements
The authors would like to acknowledge Walloon Region (Consalim) for assistant aids. We thank all the technical’s personal of CWBI (Centre Wallon de Biologie Industrielle). We also express our gratitude to Wallonie-Bruxelles International for its financial assistance.
7.	References
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Conclusion du chapitre VI
Comme nous l’avions mentionné précédemment, les étapes de la production et du conditionnement des P. fluorescens BTP1 étaient déterminantes pour la qualité du produit final sec. Dans ce travail, nous avons réalisé 2 fermenteurs en mode batch, avec le même milieu de culture mais dans des conditions différentes. Dans le premier, nous avons utilisé une contre-pression de 0,1 bar et les cellules ont été récoltées 4 h après le début de la phase stationnaire. Dans le deuxième, nous avons triplé la contre-pression et la récolte des cellules a été réalisée 2 h après la phase stationnaire. Ces résultats montrent que le fait de récolter les cellules deux heures après la phase stationnaire permet aux cellules de s’adapter aux conditions des stress liées à la carence des nutriments. Nous avons réussi à réduire le temps de culture de 24 heures à 12 heures mais en augmentant considérablement le rendement de la production. Le conditionnement de la crème a été réalisé à 4°C, ceci pour permettre aux cellules de s’adapter aux basses températures. Nous avons utilisé deux types de lyophilisation, une courte de 48 heures et une longue de 72 heures. Les résultats montrent que la lyophilisation longue donne une poudre de qualité supérieure par rapport à la lyophilisation courte. Cela se traduit par une meilleure viabilité et un meilleur taux de matière sèche. L’activité d’eau étant un peu élevée, nous avions procédé à l’ajout des composés protecteurs à la poudre avant l’emballage. Les résultats montrent qu’il est possible de produire P. fluorescens BTP1 à l’échelle industrielle.

Discussion générale

Discussion générale
Au cours de cette décennie, les bactéries du genre Pseudomonas fluorescens sont de plus en plus utilisées en agriculture, en environnement, en chimie et en médecine (Jourdain et al., 2006; Djavaheri et al., 2009; Anita and Samiyappan, 2012; Gao et al., 2012; Couillerot et al., 2009). Son besoin est en perpétuelle croissance et cela nécessite des recherches permettant de faciliter son traitement, son stockage, son transport et sa distribution. Le souci majeur des biotechnologues est la production et la commercialisation des souches bactériennes présentant une viabilité maximale. Mais P. fluorescens étant une bactérie Gram négative, elle est très sensible à toute forme de séchage (Palmfeldt et al., 2003; Miyamoto-Shinohara et al., 2008). Les travaux de cette thèse avaient pour objectif principal l’étude de mécanismes de réponse au stress de P. fluorescens lors des différentes étapes du procédé visant la production d’un starter concentré. 
Détermination de la viabilité cellulaire
La perte de la viabilité cellulaire des bactéries se produit généralement pendant les différentes étapes de la production et du stockage (Coulibaly et al., 2011). Pour toutes les applications industrielles des bactéries lyophilisées, l’obtention d’une concentration élevée des cellules viable et cultivable c.à.d. pouvant se développer sur boîte  est donc requise. La détermination de cette viabilité cellulaire est systématique. Plusieurs méthodes sont utilisées: dénombrement sur milieux gélosés, microscopie et cytométrie en flux, ATP-mètrie, etc… (Davey, 2011). Parmi ces méthodes, le dénombrement sur milieux gélosés et la cytométrie en flux ont été utilisés dans le cadre de cette thèse pour évaluer la viabilité cellulaire.
Le dénombrement sur milieux gélosés implique la croissance des colonies sur une surface de gélose nutritive pendant une période d'incubation de 24 heures. Tandis que la cytométrie en flux est une technique d’analyse des cellules, des bactéries et des particules en suspension dans un liquide qui permet de les faire passer une à une à grande vitesse devant un faisceau laser (Davey, 2011). Cette analyse rapide au niveau d'une seule cellule permet la détermination de multiples propriétés des cellules: la mesure de l'activité métabolique, l'état de la membrane, le contenu de l'ARN et / ou de l’ADN et la perméabilité membranaire. Cette technique permet des triages de sous-populations de cellules qui peuvent être caractérisées sur un spectre de: viabilité maximale, de mortalité et d’intermédiaire (Davey, 2011). La cytométrie en flux a permis de faire une discrimination des bactéries basée sur leur activité métabolique. Les analyses réalisées en cytométrie de flux  (chapitre III) sur la biomasse bactérienne avant et après lyophilisation montrent que la perte de viabilité est plus prononcée au cours du séchage qu’au cours du stockage. Ces résultats associés à ceux présentés dans le chapitre II ont permis de connaître l’état physiologique des cellules avant et après leur lyophilisation ainsi qu’à la fin de leur conservation. Ils montrent que plus de 80% des cellules sont affectées pendant la lyophilisation et une bonne partie d’entre-elles sont dans un état intermédiaire. Ces cellules à l’état intermédiaire (viables mais non cultivables) ne poussent pas sur milieu gélosé, mais peuvent reprendre leurs activités métaboliques si elles sont exposées à un environnement favorable.
Les phénomènes responsables de la perte de viabilité de la poudre lyophilisée de Pseudomonas fluorescens au cours de sa conservation.
Tous les éléments de prévisions fournis par la cytométrie en flux aboutissent à une seule conclusion, Pseudomonas fluorescens subit divers stress et modifications au niveau de la membrane cellulaire au cours du séchage et du stockage. Parmi ces modifications, notons l’oxydation des acides gras, l’oxydation du glutathion, l’oxydation des protéines, l’insolubilisation des protéines et la perte de l’intégrité membranaire. Cette oxydation est généralement due aux ROS (Leslie et al., 1995). Les ROS (Reactive Oxygen Species) sont des radicaux oxygénés (O2•-, OH) ou des molécules pouvant produire des radicaux libres très instables et très réactifs. Les dommages induits par les ROS sont : une peroxydation des lipides, une oxydation des protéines, des mutations de l'ADN (Santivarangkna et al., 2008). 
Les premières cibles des ROS sont les protéines, le DNA et les membranes phospholipidiques (figure 24). Les membranes riches en acides gras polyinsaturés (AGPI) sont très sensibles à l'oxydation en raison de leur degré élevé d'insaturation (Coulibaly, 2010). L'oxydation des lipides génère des peroxydes lipidiques qui sont eux-mêmes très réactifs (Coulibaly, 2010). Elle fournit également une grande variété de produits (Parmi ceux-ci, citons : le malondialdéhyde (MDA) et le 4-hydroxynonénal (4-HNE)) qui peuvent réagir avec les protéines et l'ADN  (Marnett, 1999). 

Figure 23. Représentation schématique de la réponse de Bacillus spp au stress oxydant primaire et secondaire (Mols and Abee, 2011)

Nous avons montré qu’au cours de la lyophilisation et du stockage, la membrane cellulaire est exposée à l’oxydation souvent initiée par la présence de l’oxygène (chapitre V). Les acides gras membranaires de P. fluorescens ont été analysés avant et après le séchage (chapitre II et chapitre III) et les teneurs en acides gras étudiées sont exprimées par le rapport entre C18:2 et C18:3 sur C16:0.  Les résultats montrent que les acides gras polyinsaturés C18:2 et C18:3 bien qu’en faible concentration et indépendamment de la température de stockage utilisée étaient les premiers à s’oxyder pendant le stockage de la poudre lyophilisée de P. fluorescens, ceci en accord avec les résultats de Coulibaly et al. (2009) sur les bactéries lactiques. Le même constat est fait sur les espèces de P. fluorescens thermophiles (BB2 et PI9) (chapitre V). Cette oxydation des acides gras polyinsaturés se traduit par la baisse des ratios acide linoléique (C18:2)/acide palmitique (C16:0) et acide linoléique (C18:3)/acide palmitique (C16:0) à 4 °C comme à 20°C.

Comme pour les acides gras, les protéines subissent aussi des dommages au cours de la lyophilisation et du stockage. Les résultats présentés dans les chapitres III et V montrent une insolubilisation des protéines au cours du stockage à 4 et 20°C d’une part, et une augmentation des groupements carbonyles durant l’exposition à l’oxygène singulet d’autre part. Ceci traduit une oxydation des protéines car les groupements carbonyle en sont des marqueurs. Pendant l’exposition des poudres lyophilisées de P. fluorescens à l’oxygène singulet, nous avons observé une forte augmentation de la concentration des groupements carbonyle pour la souche BTP1 au cours de 30 premières minutes d’exposition tandis que pour les souches BB2 et PI9, elle est plus marquée après 60 minutes. Comme pour les groupements carbonyle, la concentration en protéines solubles diminue plus pour la souche BTP1 au cours de 30 premières minutes d’exposition à l’oxygène singulet.
Les analyses de l’oxydation des acides gras et des protéines membranaires ont montré que l’oxygène est responsable des phénomènes d’oxydation des acides gras polyinsaturés et des protéines de poudres lyophilisées de P. fluorescens. Ces résultats permettent d’une part d’extrapoler les comportements des souches à une température de conservation plus basse en absence d’oxygène et de la lumière pendant une durée déterminée de conservation et d’autre part la mise en évidence de l’oxydation du matériel biologique de la cellule au cours du stockage de P. fluorescens. L’O2 initie les réactions d’oxydation des acides gras et des protéines et cette oxydation est plus rapide lorsque l’aw est élevée. Les résultats de travaux de Aguirre et al., (2009) et Yao et al., (2008) ont également prouvé que le test accéléré de mortalité était un bon indicateur de prédiction de la stabilité des souches lyophilisées pendant la conservation.
La rupture membranaire fait partie des différents dommages liés à la lyophilisation et au stockage entrainant ainsi une perte de viabilité des bactéries lyophilisées. Nos résultats montrent qu’au cours du stockage, les cellules perdent leur intégrité membranaire. La mesure de la conductivité électrique confirme la perte de l’intégrité membranaire chez P. fluorescens BTP1 et que cette perte est plus prononcée à 20°C (chapitre II). Les résultats similaires ont été trouvés pour Weissella paramesenteroides LC11 bactérie Gram positive (Yao et al., 2010). Chez P. fluorescens BTP1, la perte de viabilité est plus prononcée pendant la lyophilisation que pendant le stockage. La relation entre la perte de la viabilité des bactéries lactiques et l’oxydation des acides gras polyinsaturés a été mise évidence (Coulibaly et al., 2009; Castro et al., 1996). Et nous avons mis en évidence la relation entre l’oxydation et la viabilité cellulaire. 
La stabilité de P. fluorescens lyophilisé est évaluée au cours de leur conservation par les tests de dégradation accélérés (test de mortalité et d’oxydation). Ces différents tests font appel à des données expérimentales décrivant la perte de viabilité des souches lyophilisées à des températures élevées d’une part (chapitre IV) et en présence de l’oxygène d’autre part (chapitre V). Les résultats obtenus sont ensuite utilisés pour extrapoler le comportement des souches à une température de conservation plus basse pendant une durée de conservation déterminée. Dans notre étude, les estimations de viabilité obtenues lors du stockage des souches à 37°C et 60°C ont été confirmées par les valeurs de survie obtenues après 60 jours à 4°C. Trois souches de P. fluorescens ont été utilisées à savoir la BTP1 qui est mésophile ainsi que la PI9 et la BB2 qui sont thermophiles. Après conservation à différentes températures (60°C, 37°C et 4°C) et exposition à l’oxygène singulet, nous avons observé que P. fluorescens est très sensible à la température et à l’oxygène. La température influence de manière très significative la viabilité cellulaire pendant le stockage (Beal et al., 2001). 
Le meilleur résultat de conservation est observé à 4°C pour toutes les souches sans exception, mais à 37°C et 60°C la perte de viabilité est très prononcée pour ces trois souches (chapitre IV). Après exposition des poudres lyophilisées à l’oxygène singulet produit par photosensibilisation (exposition du bleu de méthylène à la lumière), nous avons observé une perte de viabilité prononcée après seulement quelques minutes d’exposition (chapitre V). Mais ces résultats montrent que la PI9 présente un taux de survie élevé comparativement à la BTP1 et BB2. Pour une bonne stabilité des poudres lyophilisées au cours du stockage, il est donc essentiel de conditionner les poudres sous vide dans des sachets en aluminium imperméables à l’oxygène et à la lumière.
Les systèmes antioxydant
Un antioxydant est une molécule qui diminue ou empêche l'oxydation d'autres substances chimiques. Les antioxydants sont capables de stopper ces réactions en chaîne en se réduisant avec les radicaux libres et annihilant ainsi leur action. Ces propriétés se trouvent beaucoup dans les familles des thiols. Les bactéries produisent et utilisent de nombreux antioxydants pour se protéger, tels le glutathion (GSH) et la superoxyde dismutase (qui est une enzyme). Le glutathion est un tripeptide, formé par la condensation d'acide glutamique, de cystéine et de glycine. Il est considéré comme un puissant antioxydant pour son rôle dans la protection de l’intégrité membranaire des cellules en neutralisant les radicaux libres (Richard et al., 1997; O'Malley et al., 2004). 
La plupart des fonctions biologiques de glutathion sont médiés par la conversion de glutathion réduit (GSH) à sa forme oxydée (GSSG) par l'enzyme glutathion peroxydase et la transformation en GSH par la glutathion réductase. Son rôle chez les bactéries Gram négative est bien établi: résistance aux stress oxydatifs, aux stress de rayonnement, aux stress osmotiques (Carmel-Harel et al., 2000; Moore et al., 1989; Sminova et al., 2001). Les résultats présentés dans le chapitre III montrent une diminution de la concentration du glutathion dans les poudres de Pseudomonas fluorescens au cours du stockage à 4 et 20°C. Ces résultats démontrent que le glutathion est aussi altéré au cours du stockage à 4 °C comme à 20 °C, mais que cette altération était plus prononcée à 20 °C. L’altération du glutathion rend vulnérables les cellules aux attaques des radicaux libres d’oxygène. 
Mécanisme de lutte contre les stress oxydatifs
Pour certains auteurs le fait de récolter les cellules quelques heures après la fin de la phase exponentielle est bénéfique car la carence en nutriments permet aux cellules de s’adapter aux conditions de stress plus forte encore au cours de la lyophilisation (Palmfeldt et al., 2003). Contrairement aux thiols et aux enzymes anti-oxydantes (la superoxyde dismutase, le glutathion peroxydase, le glutathion réductase, la catalase), la plupart des antioxydants ne sont pas synthétisés par la cellule et doivent être apportés de manière exogène. Dans cette catégorie d’antioxydant se trouvent le glutathion réduit, l’acide ascorbique, le butylhydroxytoluène et les composés protecteurs (maltodextrin, glycérol, diméthylsulfoxide, amidon etc.) (Coulibaly et al. 2009).
L’utilisation des composés protecteurs et des antioxydants permet d’obtenir une viabilité assez élevée après lyophilisation. Leurs effets bénéfiques ont été largement démontrés pour les bactéries Gram positives et en particulier les bactéries lactiques (Yao et al., 2009; Miyamoto-Shinohara et al., 2008; Zhao and Zhang, 2005; Berner and Viernstein, 2006; Saarela et al., 2005; Castro et al., 1995; Castro et al., 1996; Carvalho et al., 2003). Nos résultats (chapitre II et III) montrent que P. fluorescens BTP1, en l’absence des composés protecteurs, est très sensible au séchage et que l’ajout des composés protecteurs (2% de glycérol ou 5% de maltodextrine) permet de maintenir une viabilité plus élevée après la lyophilisation et au cours du stockage à 4 °C comme à 20°C. Ces composés permettent aussi de réduire l’oxydation des acides gras polyinsaturés au cours du stockage. Les résultats du chapitre III montrent que l’oxydation des acides gras polyinsaturés est plus prononcée pour les poudres sans composés protecteurs. Ces résultats sur l’oxydation des acides gras polyinsaturés sont en accord avec les travaux réalisés sur les bactéries Gram positives par (Coulibaly et al., 2009).
À la lumière de ce qui précède, nous pouvons utiliser ces données pour optimiser la production de la poudre lyophilisée de Pseudomonas fluorescens en fermenteur.
L’optimisation de la production en fermenteur et du stockage de la poudre lyophilisée de Pseudomonas fluorescens BTP1.
La production en fermenteur de P. fluorescens est l’un des facteurs déterminants qui influe sur la qualité du produit à l’étape de la lyophilisation. La production est subdivisée en 3 grandes phases à savoir: la phase de croissance, la phase stationnaire et la phase de mortalité. La maitrise de ces phases permet d’améliorer la production. Palmfeldt et al. (2003), Morgan et al. (2005) ont montré que le fait de récolter les cellules à la phase stationnaire augmente la survie après le séchage. La phase stationnaire induits différents états physiologiques dans les cellules en raison de la carence en carbone et en nutriments et déclenche des réactions de stress qui permettent la survie des cellules.

Figure 24. Schéma descriptif de la production en  fermenteur (100L) de Pseudomonas fluorescens. A. avant thèse, B. après thèse.
La figure 24 décrit le schéma de la production de Pseudomonas fluorescens en fermenteur utilisé avant et après nos recherches doctorales ; avec les différentes modifications qui ont conduit à une augmentation du rendement. Les résultats présentés au chapitre VI montrent que l’augmentation de la contre-pression dans un fermenteur permet de maintenir un taux élevé d’oxygène dissous dans le réacteur et améliore la production de P. fluorescens. Les cellules récoltées après la phase stationnaire présentent une résistance plus élevée à la lyophilisation que les cellules récoltées au début de la phase stationnaire. Le conditionnement de la crème a été réalisé à 4°C, ceci pour permettre aux cellules de s’adapter aux basses températures. Nous avons utilisé deux types de lyophilisation, une courte de 48 heures et une longue de 72 heures. Les résultats montrent que la lyophilisation longue donne une poudre de qualité supérieure par rapport à la lyophilisation courte. Tous ces essais se traduisent par une meilleure viabilité et un meilleur taux de matière sèche. À titre d’exemple : un taux de 18% pour les cellules récoltées après la phase stationnaire est observé contre un taux de 4,1% pour celles récoltées au début de la phase stationnaire. Nous avons aussi mis en exergue l’impact des composés protecteurs au cours de la lyophilisation ainsi que l’effet de synergie des différents protecteurs (glycérol et maltodextrine). Les résultats montrent que le fait d’utiliser une combinaison des 2 composés protecteurs, permet d’augmenter le rendement pendant la lyophilisation de Pseudomonas fluorescens.
Le temps de production en fermenteur de P. fluorescens a été réduit presque de moitié, nous sommes passés de 22 heures à 12 heures. Selon Jørgensen et al. (1994), l’activité d’eau de P. fluorescens doit être comprise entre 0,2 et 0,4.

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Conclusions générales et perspectives

Conclusions générales et perspectives
1.	Conclusions 
Au cours de la production et de la lyophilisation, les cellules sont soumises à différents stress (physico-chimique) conduisant à une perte de viabilité considérable. L’optimisation des conditions de production et de lyophilisation permet l’obtention d’une poudre possédant des propriétés technologiques intéressantes et une bonne résistance au séchage. Afin d’améliorer la résistance au séchage des bactéries, une approche intéressante consiste à adapter les cellules, en les soumettant à un stress modéré pendant leur production, avant leur exposition à un stress plus fort lors de la lyophilisation. Ce stress modéré permet aux cellules de développer des mécanismes physiologiques de défense et d’adaptation qui leurs permettront de mieux résister aux stress pendant la lyophilisation. 
Ce travail a d’abord permis la compréhension de certains mécanismes responsables de la mortalité des poudres lyophilisées au cours du stockage (phénomènes d’oxydation, perte de l’intégrité membranaire et la température de stockage) d’une part et la production d’une poudre présentant un meilleur taux de survie après le stockage d’autre part. Dans la première partie de notre étude, notre travail a consisté en une description de la bactérie P. fluorescens ainsi qu’à l’évaluation des différentes techniques de séchage et les conséquences liées à la lyophilisation (chapitre I). Nous avons montré que la lyophilisation cause des dommages aux cellules ce qui entraine une perte de viabilité prononcée au cours du séchage et que l’ajout des substances protectrices avant la lyophilisation permettait de maintenir une bonne viabilité des cellules après le séchage et pendant le stockage.
Les résultats présentés dans les chapitres II et III montrent l’impact des composés protecteurs sur les bactéries pendant le processus de séchage et de conservation. Il ressort de cette étude que le glycérol protège mieux les cellules pendant la lyophilisation comparativement à la maltodextrine. Le glycérol permet d’obtenir une poudre présentant une meilleure survie après la lyophilisation et au cours du stockage tout en réduisant les phénomènes d’oxydation lipidique. Nous avons également démontré qu’à côté de l’oxydation lipidique, nous avons une dégradation des protéines (oxydation et insolubilisation) et un dommage du glutathion, tripeptide qui joue un rôle très important dans la protection de la cellule contre les stress oxydatifs. Enfin, la cytométrie en flux nous a permis de comprendre que la perte élevée de viabilité observée chez P. fluorescens BTP1 était plus due à la lyophilisation et non à la conservation. L’intégrité cellulaire a été évaluée par la détermination du nombre de cellules viables et la conductivité électrique du milieu. Une baisse du nombre de cellules viables pendant la conservation et une augmentation de la concentration en substances ioniques dissoutes durant les 4 premières heures de la réhydratation dans de l’eau Milli Q ont été ainsi observées. Il ressort de cette étude qu’il est donc important de conditionner la poudre lyophilisée de P. fluorescens dans un emballage imperméable à la lumière et à l’oxygène pour limiter les phénomènes d’oxydation.
Dans le chapitre IV, trois souches lyophilisées de P. fluorescens (BTP1, BB2 et PI9) ont été étudiées en utilisant la théorie d’Arrhénius (test accéléré de mortalité). Les souches lyophilisées et conservées dans des tubes en verre ont été stockées à différentes températures (37°C et 60°C). Des échantillons ont été prélevés à des intervalles de temps bien définis pour la détermination de la viabilité cellulaire. Les résultats obtenus lors du stockage des souches à 37°C et 60°C ont été comparés à la viabilité observée après 60 jours de stockage à 4°C. Ces résultats permettent de prédire la stabilité au stockage des poudres lyophilisées de Pseudomonas fluorescens à différentes températures. Avec une valeur de R² proche de l’unité, celle-ci indique l’applicabilité de la théorie d’Arrhenius. Comme l’on pouvait s’y attendre, les souches thermophiles de P. fluorescens (BB2 et PI9) ont montré une stabilité beaucoup plus grande que la souche mésophile (BTP1) à 37 et 60°C. Mais la température de stockage de 60°C a un effet destructeur sur la viabilité des P. fluorescens lyophilisés. Nous pouvons donc conclure que la viabilité de P. fluorescens lyophilisé est liée aux conditions de stockage.
Dans le chapitre V nous avons procédé à un test accéléré d’oxydation par l’exposition à l’oxygène singulet de poudres lyophilisées. Les résultats présentés dans ce chapitre mettent en relation le phénomène d’oxydation avec les paramètres physiologiques (composition en acides gras et le contenu en protéines). Durant l’exposition de nos poudres lyophilisées à l’oxygène singulet, nous avons observé une diminution de la viabilité accompagnée d’une oxydation des acides gras polyinsaturés et des  protéines. Ces résultats montrent que les poudres de souches thermophiles (BB2 et PI9) s’oxydent après l’oxydation de la souche mésophile (BTP1). Ceci vient confirmer l’hypothèse selon laquelle l’oxygène est en partie responsable de la mortalité cellulaire au cours du stockage des poudres lyophilisées de P. fluorescens. Un conditionnement sous vide et dans un emballage imperméable à la lumière et à l’oxygène permettra de maintenir cette viabilité durant une longue période de conservation.
Ces résultats montrent que l’oxygène est responsable de la perte de viabilité de cellules car il génère différentes réactions d’oxydation au niveau cellulaire (oxydation des acides gras et des protéines).
Le chapitre VI a été consacré à l’optimisation de la production en fermenteur de P. fluorescens, les résultats montrent que le fait de récolter les cellules deux heures après la phase stationnaire permet aux cellules de s’adapter aux conditions de stress liées à la carence en nutriments. Le temps de culture est réduit de 24 heures à 12 heures en augmentant considérablement le rendement de la production. Le conditionnement de la crème a été réalisé à 4°C, ceci pour permettre aux cellules de s’adapter aux basses températures. Nous avons utilisé deux types de lyophilisation, une courte de 48 heures et une longue de 72 heures. Les résultats montrent que la lyophilisation longue donne une poudre de qualité supérieure par rapport à la lyophilisation courte. Cela se traduit par une meilleure viabilité et un meilleur taux de matière sèche. La combinaison des différents composés protecteurs et antioxydants permet de minimiser la perte de viabilité pendant la lyophilisation.
L’analyse de l’ensemble de ces résultats permet de conclure que le séchage (lyophilisation) affecte considérablement la viabilité de P. fluorescens BTP1 plus que la conservation et au cours de la conservation, les poudres lyophilisées sont sensibles à la température et aux phénomènes d’oxydation liés à la présence d’oxygène. Afin de minimiser les effets liés à la perte de viabilité, on a recours à des composés protecteurs (acide ascorbique, glycérol et maltodextrine) et au conditionnement dans un emballage en aluminium (imperméable à la lumière et à l’oxygène) sous vide des poudres lyophilisées de P. fluorescens BTP1. Pour optimiser la production de P. fluorescens BTP1, il conviendra de miser sur la contre pression pendant la croissance, le temps de récolte, la durée du séchage et la qualité du conditionnement. Ces résultats permettent d’identifier les conditions opératoires nécessaires pour la production d’une poudre à viabilité élevée,  donc intéressant pour une application industrielle.

2.	Perspectives 
Ce travail constitue à ce niveau une contribution pouvant être valorisée tant à l’échelle de laboratoire qu’à l’échelle industrielle. Au-delà des conclusions tirées des différentes recherches réalisées dans ce travail, nous soulevons des points intéressants qui demandent des travaux complémentaires:
1.	L’étude des mécanismes d’oxydation de l’ADN au cours de la conservation des poudres lyophilisées de P. fluorescens BTP1,
2.	La stimulation d’excrétion des exopolysaccharides pour augmenter la résistance des cellules aux différents stress,
3.	La possibilité de réaliser technologiquement une barrière à l’oxygène par encapsulation de la poudre lyophilisée de P. fluorescens BTP1 ou par enrobage en utilisant une fine couche d’une matière hydrophobe afin de minimiser au maximum les risques de dégradation des bactéries liées aux stress physico-chimiques tels que la chaleur, l’humidité et l’oxygène,
4.	Pour les pays en voie de développement, l’utilisation de P. fluorescens BTP1 lyophilisé dans l’agriculture. 

Tableaux et figures
Liste des tableaux
Tableau 1. Quelques caractéristiques et substances utilisées comme cryoprotecteurs intracellulaires (CPI) et extracellulaires (CPE) d’après Coulibaly et al. (2011).
Tableau 2. Viabilité des Pseudomonas après les différentes opérations de séchage.
Table 3. Concentration of Pseudomonas fluorescens BTP1 (Log CFU/g) after months 7 storage at 4°C and 20°C
Table 4. Cellular fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens before and after freeze-drying
Table 5. Cellular fatty acid composition of Pseudomonas fluorescens BTP1 before and after freeze-drying
Table 6. Decimal reduction time (D) or rate constant (k) for freeze-dried P. fluorescens strains.
Table 7. Various parameters of the production in bioreactor of P. fluorescens BTP1.
Table 8. Percentage survival, water activity and dry matter of different combinations of protective compounds after freeze-drying.

Liste des figures
Figure 1.  Différence entre la paroi d’une bactérie Gram négative et Gram positive d’après Tripathi et al. (2012)
Figure 2. Le mécanisme de la modification oxydative des protéines (d’après Petropoulos, 2011)
Figure 3. Survival CFU/g and electrical conductivity of P. fluorescens BTP1 during storage at 4 and 20°C. Powder without protective compounds (PS), powder with maltodextrin (PM) and powder with glycerol (PG)
Figure 4. P. fluorescens BTP1 after PI/cFDA double staining. 1. Powder without protective compounds (PS), 2. Powder with 5% maltodextrin (PM). 3. Powder with 2% glycerol (PG) at 20°C.
Figure 5. C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios of Pseudomonas fluorescens BTP1 during 60 days storage at 4°C or 20°C in vacuum-sealed aluminium foil.    : Powder without protective compounds (PS),     : powder with 5% maltodextrin (PM),     : powder with 2% glycerol
Figure 6. Survival CFU/g of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP1 during 90 days storage at 4°C and 20°C (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)
Figure 7. Evolution of the concentration of soluble protein during storage at 4 and 20°C of Pseudomonas fluorescens BTP1 powder (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)
Figure 8. C18:2/C16:0 and C18:3/C16:0 ratios of Pseudomonas fluorescens BTP1 powders during 90 days storage at 4°C or 20°C in vacuum-sealed aluminium foil
Figure 9. Concentration of glutathione (GSH) in P. fluorescens BTP1freeze-drying during storage at 4 and 20°C (■: PS 4°C, ●: PG 4°C, ▲: PS 20°C, ▼: PG 20°C)
Figure 10. Flow cytometry analyzed of Pseudomonas fluorescens BTP1 after PI/cFDA double staining (A.Cream of cells before freeze-drying, B. Powder with 2% glycerol, C. Powder without glycerol).
Figure 11. Thermal mortality curves of freeze-dried Pseudomonas fluorescens strains (A. BTP1, B. PI9, C. BB2) at ▲4°C, ● 37°C and ■ 60°C. Each point represents the mean of tree counts.
Figure 12. Determination of activation energy (Ea) of freeze-drier Pseudomonas fluorescens strains (♦: BTP1, ■: BB2, ▲: PI9)
Figure 13. Effect of MB/light on viability of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) over 90 minutes.
Figure 14. Fatty acids evolution after P. fluorescens exposure to Methylene Blue/ light
Figure 15. Protein content of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) during a 90 minute exposure to 25 mM MB/ light
Figure 16. Protein carbonyl content of P. fluorescens strains (■: PI9; ●: BTP1; ▲: BB2) during a 90 minute exposure to 25 mM MB/ light
Figure 17. Evolution of viability, optical density, oxygen and base (KOH) during the production of Pseudomonas fluorescens BTP1 in the first bioreactor.
Figure 18. Evolution of viability, optical density, oxygen and base (KOH) during the production of Pseudomonas fluorescens BTP1 in the second bioreactor.
Figure 19. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP during storage at 4°C in aluminum bag under vacuum with and without protectors
Figure 20. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas fluorescens BTP 1 during storage at room temperature in aluminum bag under vacuum with and without protectors
Figure 21. Loss in survival of freeze-dried P. fluorescens BTP during storage at 4°C in aluminum bag under vacuum with and without protectors
Figure 22. Loss in survival of freeze-dried Pseudomonas  fluorescens BTP during storage at room temperature in aluminum bag under vacuum with and without protectors
Figure 23. Représentation schématique de la réponse de Bacillus spp au stress oxydant primaire et secondaire (Mols and Abee, 2011)
Figure 24. Schéma descriptif de la production en  fermenteur (100L) de Pseudomonas fluorescens. A. avant thèse, B. après thèse.